【摘 要】
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本论文以内蒙古农业大学微生物实验室保存的鼠李糖乳杆菌XA2-14菌株为研究对象,采用牛津杯法对鼠李糖乳杆菌XA2-14培养液进行酸性产物及H2O2产物排除试验、蛋白酶水解试验、酸碱稳定性试验等来确定该菌产生的抑菌物质为细菌素,随后从分子水平检测其细菌素WO-A/2操纵子,以提取的鼠李糖乳杆菌XA2-14全基因组为模板,根据Gen Bank（HV942910.1）发布的WO-A/2基因的全序列设计一
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本论文以内蒙古农业大学微生物实验室保存的鼠李糖乳杆菌XA2-14菌株为研究对象,采用牛津杯法对鼠李糖乳杆菌XA2-14培养液进行酸性产物及H2O2产物排除试验、蛋白酶水解试验、酸碱稳定性试验等来确定该菌产生的抑菌物质为细菌素,随后从分子水平检测其细菌素WO-A/2操纵子,以提取的鼠李糖乳杆菌XA2-14全基因组为模板,根据Gen Bank（HV942910.1）发布的WO-A/2基因的全序列设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出目的片段,经回收纯化后将目的片段连接于p MD19-T载体上,并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。经验证筛选,对阳性克隆进行鉴定分析,克隆到p ET-32a（+）表达载体转入E.coli BL21（DE3）感受态中。经过Amp+平皿筛选,质粒双酶切鉴定和菌落PCR两步验证,成功获得重组阳性质粒,利用IPTG诱导表达感受态E.coli BL21（DE3）,通过SDS-PAGE电泳,显示在26k Da左右出现条带,此结果与预期的细菌素WO-A/2蛋白分子量大小符合。之后对细菌素WO-A/2蛋白诱导条件进行优化,确定细菌素WO-A/2蛋白的最佳诱导时间为8h,诱导剂IPTG浓度为1.0mmol/L。采用Ni-NTA亲和层析柱、梯度透析复性的纯化方法对细菌素WO-A/2蛋白进行纯化,最终所纯化出的蛋白浓度为0.877±0.042mg/m L。随后对细菌素WO-A/2蛋白的抑菌能力进行了抑菌试验,结果其最小抑菌浓度为34.93±1.28μg/m L,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达18.19±0.40mm,说明该细菌素对金黄色葡萄球菌有着较好的抑菌作用,对细菌素WO-A/2蛋白的生物安全性进行了溶血性试验及量化试验,结果表明该细菌素WO-A/2蛋白具有一定的生物安全性,有成为替代食品防腐和抗菌药物的可能。采用AO/EB双荧光染色方法同商品化的Nisin进行比较,探究其抑菌能力并对细菌素WO-A/2蛋白的作用机制进行初步探究,结果证实细菌素WO-A/2蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌作用是通过破坏细菌细胞膜导致细胞凋亡实现。本研究结果为鼠李糖乳杆菌细菌素成为安全可靠的生物替抗剂提供了参考依据和数据支持。
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