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目的:放射治疗是肿瘤综合治疗的一个重要组成部分,65~75%的癌症患者治疗过程中需要用到放疗。放疗利用电离辐射的直接作用造成DNA断裂和间接作用产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),进而损伤生物大分子,两方面的生物学效应对肿瘤细胞发挥杀伤作用。然而,电离辐射对肿瘤组织物理力学特征的影响依旧知之甚少。细胞通过力学感受器接收外界物理力学信号,并由细胞骨架系统产生相对应的细胞内部物理力学系统和信号传递系统。细胞力学系统失调会导致包括肿瘤在内的多种疾病。最近的研究显示,肿瘤组织中机械转导通路的改变也是肿瘤发生迁徙的重要成因之一。因此关于机械转导通路与癌症放射治疗之间是否存在联系亟待解决。在前期工作中本课题组发现电离辐射诱导的长链非编码 RNA CRYBG3(Crystallin beta-gamma domin containing 3)能够直接结合球型肌动蛋白(Globular actin,G-actin)以抑制其聚合,导致细胞M期阻滞,发挥抑癌基因的功能。并且在动物实验中证实在肿瘤中敲除lncRNA CRYBG3后肿瘤恶性程度的升高。LncRNA CRYBG3与G-actin结合能阻断其形成丝状肌动蛋白(Fibrous actin,F-actin),那么lncRNA CRYBG3是否会通过细胞骨架系统来调控机械转导通路呢?因此,本课题采用肺癌细胞和小鼠移植瘤模型,从机械转导通路的角度入手,研究电离辐射敏感应答的lncRNA CRYBG3对机械转导通路的影响。LncRNA CRYBG3是否作为连接电离辐射和机械转导通路的纽带,通过调节机械转导通路效应分子YAP/TAZ的转录活性来调控肺癌的增殖和侵袭转移。方法:(1)构建荷瘤小鼠,在采用电子计算机断层扫描(Computed Tomography,CT)引导的肿瘤区域X射线精准辐照后,使用原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)检测实验、天狼星红染色实验和免疫荧光实验分别检测电离辐射后肿瘤组织的硬度、胶原纤维含量以及磷酸化的肌球蛋白轻链 2(Phosphorylated myosin light chain 2,p-MLC2)的变化,评价电离辐射对肿瘤组织的力学特征影响;(2)构建A549-lncRNA CRYBG3 shRNA荷瘤模型或者构建A549细胞lncRNA CRYBG3过表达荷瘤模型,使用原子力显微镜检测实验和免疫荧光实验分别检测这些肿瘤组织的硬度以及p-MLC2的变化,评价lncRNA CRYBG3对肿瘤组织的力学特征影响;以及使用原子力显微镜检测实验和免疫荧光实验分别检测A549细胞过表达lncRNA CRYBG3后的杨氏模量以及p-MLC2的变化,以评估肿瘤细胞本身的力学性质;(3)使用真核细胞转录组高通量测序,检测lncRNA CRYBG3调控的下游通路;LncRNA CRYBG3对机械转导通路效应分子YAP/TAZ的调控研究主要采用肺癌细胞系A549和Calu-1,在肿瘤细胞中高表达或者沉默lncRNA CRYBG3,并使用免疫荧光实验、免疫印迹实验、实时荧光定量PCR实验以及萤光素酶报告实验分别检测YAP/TAZ的蛋白定位、表达水平及其下游靶基因表达,评价lncRNA CRYBG3对YAP/TAZ的转录活性影响;(4)LncRNA CRYBG3对肺癌的生物学效应的研究主要通过构建lncRNA CRYBG3和/或TAZ敲低的A549细胞株,使用克隆形成实验、Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测肺癌细胞的生长和侵袭转移能力的变化;构建荷瘤模型和尾静脉注射体内转移模型,使用肿瘤体积监测、免疫组化实验和小动物成像实验分别检测其动物皮下肿瘤的生长、Ki67表达变化以及肺癌细胞在各脏器的转移变化,评估lncRNA CRYBG3对肺癌生长及侵袭转移能力的调控;(5)和(6)为了探讨lncRNA CRYBG3是否通过抑制细胞骨架微丝的形成从而调控效应分子YAP/TAZ的转录活性,我们使用了外源性药物Jasplakinolide处理和干扰内源性分子ADF/CFL1表达两种方法来抑制A549和Calu-1细胞株内肌动蛋白微丝的解聚,使用原子力显微镜检测实验、免疫荧光实验、实时荧光定量PCR实验和萤光素酶报告实验分别检测抑制lncRNA CRYBG3造成的细胞骨架解聚能否恢复细胞的杨氏模量、YAP/TAZ的蛋白定位、下游靶基因的表达和转录活性水平;(7)最后为了探讨细胞骨架通过何种途径影响YAP/TAZ,我们使用免疫印迹实验检测了 Hippo通路关键激酶LATS1的磷酸化水平,同时使用免疫荧光实验、实时荧光定量PCR实验和萤光素酶报告实验分别检测LATS1/2干扰与lncRNA CRYBG3过表达联合处理能否恢复细胞骨架微丝解聚以及YAP/TAZ的转录活性水平。结果:(1)接受电离辐射的肿瘤组织杨氏模量明显降低。同时天狼星红染色发现,电离辐射能够减少肿瘤组织内的胶原纤维含量。免疫荧光实验发现,电离辐射能够降低肿瘤组织内的p-MLC2表达水平;(2)同时我们得到了与X射线照射移植瘤相似的表型,在肿瘤组织内过表达lncRNA CRYBG3能够显著降低其杨氏模量以及p-MLC2表达水平,而lncRNA CRYBG3的敲低则能增加肿瘤组织的杨氏模量和p-MLC2表达水平。在细胞水平,过表达lncRNA CRYBG3也能够显著降低肿瘤细胞的杨氏模量以及p-MLC2表达水平;(3)通过对高通量测序数据进行基因富集分析(Gene-set enrichment analysis,GSEA)发现,绝大部分YAP/TAZ靶基因的表达水平在lncRNA CRYBG3高表达的A549细胞中显著受抑制。免疫荧光实验发现,过表达lncRNA CRYBG3能够显著抑制肌动蛋白微丝的形成,同时YAP/TAZ也出细胞核滞留在胞质。为了更进一步证明YAP/TAZ出核,我们做了细胞亚组分分离实验,通过检测细胞质和细胞核内YAP蛋白的表达发现,过表达lncRNA CRYBG3后,YAP蛋白在胞质内明显增加,而在细胞核内明显减少。实时荧光定量PCR实验发现,过表达lncRNA CRYBG3后,YAP/TAZ的经典靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的mRNA表达水平明显降低。同时使用含YAP/TEAD靶启动子的萤光素酶报告基因载体发现,lncRNA CRYBG3能够显著降低内源性YAP/TAZ的转录活性。相反,lncRNA CRYBG3的敲低则能显著增强YAP/TAZ的转录活性;(4)接下来我们检测了 lncRNA CRYBG3在肺癌中的生物学效应。细胞克隆形成实验结果表明,敲低lncRNA CRYBG3能够显著增加肺癌细胞的克隆形成能力,而这种能力的增加能够被TAZ的抑制所恢复。在移植瘤模型中,缺失TAZ能够恢复lncRNA CRYBG3敲低所造成的肿瘤生长加快、肿瘤体积增加和Ki67表达增多。同时,使用Transwell侵袭实验和细胞划痕实验也发现,lncRNA CRYBG3能够促进肺癌细胞的侵袭转移,并且能够被TAZ沉默所恢复。除此之外,通过构建体内转移小鼠模型发现,lncRNA CRYBG3促进肺癌细胞的肺部转移,这种体内转移能力的增加能够被敲低TAZ所恢复;(5)和(6)我们探讨了 lncRNA CRYBG3调控YAP/TAZ的潜分子机制。结果发现,使用促进细胞骨架过度聚合的Jasplakinolide或者通过干扰ADF/CFL1的表达来抑制F-actin的解聚后,lncRNA CRYBG3引起的细胞杨氏模量降低被恢复。同时抑制细胞骨架解聚能够恢复lncRNA CRYBG3造成的YAP/TAZ转录活性降低;(7)我们进一步探讨细胞骨架通过何种机制调控YAP/TAZ转录活性。通过实验发现,Hippo通路关键激酶LATS1/2在其中发挥了重要作用,lncRNA CRYBG3能够显著增加磷酸化LATS1的表达,进而导致YAP的磷酸化,最终导致YAP滞留胞质并降解。同时免疫荧光实验发现,敲低LATS1/2能够恢复lncRNA CRYBG3造成的YAP/TAZ转录活性减低,但不能恢复lncRNA CRYBG3造成的细胞骨架解聚。结论:电离辐射诱导的lncRNA CRYBG3可以通过干扰机械转导通路来抑制YAP/TAZ的转录活性,从而限制肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。在小鼠体内,我们发现lncRNA CRYBG3的缺失可以促进肺癌的生长和转移能力,但这些效应被伴随的TAZ沉默所消除。在分子水平上,lncRNA CRYBG3能够抑制肌动蛋白微丝,促进LATS1/2的磷酸化,进而导致YAP/TAZ磷酸化并滞留在胞质内,最终YAP/TAZ不能入核促使其不能发挥转录调控功能。我们的研究提出,lncRNA CRYBG3可以通过控制肿瘤组织的机械转导和连接YAP/TAZ转录活性来控制肺癌的生长和转移,从而在肿瘤放疗中发挥重要的调控作用。