壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织及肝状细胞Akt、XIAP因子表达的影响

来源 :广西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wyzhen
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目的:本课题旨在从在体和离体两方面观察研究壮肝逐瘀煎对肝纤维化(Hepatic Fibrosis,HF)大鼠肝组织及肝星状细胞(Hepatic stellate Cell,HSC)Akt、XIAP因子表达的影响,进一步阐释壮肝逐瘀煎抗肝纤维化的作用机制,为中医药治疗肝纤维化提供实验依据。  方法:(1)在体实验:选用102只体重约220~250g的健康清洁级SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,雌雄各半,为实验对象。随机选取14只作为正常对照组(A组)。剩余大鼠采用CCL4复合因素大鼠肝纤维化模型造模方法,进行肝纤维化造模。在第4周末A组及造模组大鼠随机各处死4只,进行病理检测,显示有肝组织纤维化形成,证实造模成功。然后剩余造模大鼠则随机分为:病理模型组(B组)、壮肝逐瘀煎大、中、小剂量(C组、D组、E组)治疗组、大黄蟅虫丸及秋水仙碱(F组、G组)对照组,每组分为14只大鼠,共六个组。造模4周后,给予壮肝逐瘀煎大、中、小剂量、大黄蟅虫丸及秋水仙碱组灌胃给药和正常组和模型组生理盐水,灌胃液体用量标准为1ml/100g,1次/天,按体表面积折算药物浓度和等效剂量。7组大鼠用不同剂量药物治疗6周后,禁食12小时,每组取10只大鼠,经10%水合氯醛麻醉后,再通过股静脉采血后处死,立即剖取肝脏,取肝脏右叶大致相同部位组织两块,一块置入10%甲醛中,留作常规石蜡切片,另一块于液氮中保存以备提取RNA,对其进行分子生物学及组织学检测。(2)离体实验:选用300-350g体重的清洁级SD大鼠20只,随机分为生理盐水组、壮肝逐瘀煎大剂量组、壮肝逐瘀煎中剂量组、壮肝逐瘀煎小剂量组及秋水仙碱组。按不同药液灌喂1周后,取各组动物血清冷藏备用。取出冻存的HSC-T6细胞株,将HSC-T6细胞株放在37℃C、5%CO2混合气体的孵箱中,用含青霉素(100U/ml)、胎牛血清(10%)和链霉素(100U/ml)的1640培养基培养和传代。当细胞状态达到良好后,将所有细胞用无血清的1640培养基培养24小时。取出之前培养的细胞,弃掉里面的培养液,加入适量相应制备好的动物血清培养基(生理盐水血清组、秋水仙碱药物血清组及壮肝逐瘀煎大、中、小剂量药物血清组)。置入37℃C、5%CO2的培养箱中培养24小时。再取出每组1瓶动物血清干预培养的细胞,向上述培养瓶中加入0.4m10.25%胰酶进行消化,离心,低温保存,培养48小时,对比48小时和24小时细胞培养差别。  本实验用肉眼观察大鼠的主要症状和体征;观察肝组织的大体形态结构变化;用逆转录一聚合酶链反应法(reverse tralscriptase polymerasechain reaction,RT-PCR)检测肝组织和肝星状细胞Al、XIAP基因表达水平;用western blot法检测肝星状细胞Akt蛋白的表达水平;用流式细胞术检测HSC-T6细胞的凋亡率。  结果:(1)实验动物一般体征观察:壮肝逐瘀煎组,尤其是大剂量组可明显改善肝纤维化模型组大鼠的精神状态、活动量、饮食和皮毛色泽,其体重也有所增长。(2)肝纤维化大鼠肝脏组织大体形态的观察:壮肝逐瘀煎各组治疗后肝脏组织形态较模型对照组改善较为明显,大、中剂量组尤为显著。(3) RT-PCR检测大鼠肝组织中Akt、XIAPmRNA表达情况:①壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织AktmRNA表达的影响:结果显示壮肝逐瘀煎治疗组、大黄蟅虫丸组及秋水仙碱组均能降低AktmRNA的表达(P<0.05);壮肝逐瘀煎大剂量组效果最好(P<0.01),壮肝逐瘀煎中剂量组次之;壮肝逐瘀煎小剂量组和秋水仙碱组效果相当。②壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织XIAPmRNA表达的影响:结果显示壮肝逐瘀煎大剂量组能明显降低XIAPmRNA的表达(P<0.01);壮肝逐瘀煎中剂量组和大黄蟅虫丸组也能降低XIAPmRNA的表达(P<0.05);壮肝逐瘀煎小剂量组和秋水仙碱组效果相当。(4) RT-PCR检测大鼠肝星状细胞Akt、XIAPmRNA表达的情况:随着实验时间的延长,壮肝逐瘀煎各治疗组及秋水仙碱组均能降低大鼠肝星状细胞Akt、XIAPmRNA的表达(P<0.05),其中以壮肝逐瘀煎大剂量组最为显著(P<0.01);实验48h壮肝逐瘀煎大剂量组肝星状细胞Akt、XIAPmRNA的表达较实验24h壮肝逐瘀煎大剂量组明显降低(P<0.01)。(5)用western blot法检测肝星状细胞Akt蛋白表达情况:结果显示,壮肝逐瘀煎各治疗组、秋水仙碱组均能下调大鼠肝星状细胞内Akt蛋白的比值水平(P<0.05),其中以壮肝逐瘀煎大剂量组的下调最为显著(P<0.01)。实验48h壮肝逐瘀煎大剂量组肝星状细胞Akt蛋白的表达较实验24h壮肝逐瘀煎大剂量组明显下调(P<0.01)。(6)流式细胞术检测结果显示:壮肝逐瘀煎各治疗组、秋水仙碱组与正常组相比,肝星状细胞的凋亡率均明显提升(P<0.01),有统计学意义;壮肝逐瘀煎各治疗组效果优于秋水仙碱组(P<0.05),有统计学意义。  结论:壮肝逐瘀煎能通过调控肝纤维化大鼠肝组织和肝星状细胞Akt、XIAP因子的表达,抑制肝星状细胞的活化和增值,诱导肝星状细胞的凋亡,达到抗肝纤维化的作用。
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