【摘 要】
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目的:验证胆道闭锁患儿外周血外泌体中miRNA-29b及肝组织中PDGF高表达;探讨外泌体中高表达的miRNA-29b调控PDGF高表达,激活肝星状细胞参与胆道闭锁肝纤维化的机制。方法:收集胆道闭锁（BA）和胆总管扩张症（CC）的外周血外泌体,通过RT-PCR检测miRNA-29b表达情况。收集BA和CC的肝组织,通过RT-PCR、Western Blot检测肝组织中PDGFA的表达情况;使用mi
【基金项目】
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国家自然科学基金（81760099）; 遵义市科技计划[遵市科合HZ字（2019）104号]；
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目的:验证胆道闭锁患儿外周血外泌体中miRNA-29b及肝组织中PDGF高表达;探讨外泌体中高表达的miRNA-29b调控PDGF高表达,激活肝星状细胞参与胆道闭锁肝纤维化的机制。方法:收集胆道闭锁（BA）和胆总管扩张症（CC）的外周血外泌体,通过RT-PCR检测miRNA-29b表达情况。收集BA和CC的肝组织,通过RT-PCR、Western Blot检测肝组织中PDGFA的表达情况;使用miRNA-29b异常表达慢病毒感染jurkat细胞,应用倒置荧光显微镜、RT-PCR验证稳转株,收集各组的外泌体,应用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、纳米流式技术、RT-PCR对提取的外泌体进行鉴定,将各组外泌体、各组外泌体+DNA甲基转移酶抑制剂5-Azac分别与LX-2细胞进行共培养,应用RT-PCR、Western Blot检测DNMT3a/DNMT3b/PDGFA/COL1A1/α-SMA在转录、蛋白水平的表达情况,应用亚硫酸氢盐法检测PDGFA的DNA甲基化情况,CCK-8测细胞增殖能力。结果:（1）BA外周血外泌体中的miRNA-29b表达明显高于CC外周血外泌体中的miRNA-29b。（2）BA肝组织的PDGFA m RNA及蛋白水平表达明显高于CC肝组织的PDGFA m RNA及蛋白水平表达。（3）miRNA-29b异常表达慢病毒成功感染jurkat细胞,构建稳转株,各组稳转株中表达GFP荧光的细胞数均大于85%,过表达miRNA-29b的慢病毒感染jurkat细胞,其miRNA-29b的表达量高于空白对照及阴性对照组（76.05±1.24 vs.1.03±0.04 vs.1.05±0.05;P＜0.05）,低表达miRNA-29b的慢病毒感染的jurkat细胞,其miRNA-29b的表达量低于空白对照及阴性对照组（0.60±0.02 vs.1.06±0.04 vs.1.03±0.03;P＜0.05）。（4）透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、纳米流式技术均证实提取到了外泌体,过表达miRNA-29b的外泌体中miRNA-29b的表达明显高于空白对照及阴性对照组（30.20±0.83 vs.1.05±0.05 vs.0.99±0.05;P＜0.05）,低表达miRNA-29b的jurkat细胞的外泌体中miRNA-29b的表达量明显低于空白对照及阴性对照组（0.70±0.02 vs.1.07±0.05 vs.1.02±0.06;P＜0.05）。（5）与过表达miRNA-29b的外泌体共培养的LX-2细胞DNMT3a、DNMT3b的转录水平和蛋白表达下调,PDGFA转录水平和蛋白表达上调,COL1A1、α-SMA转录水平和蛋白表达上调。（6）与低表达miRNA-29b的外泌体共培养的LX-2细胞DNMT3a、DNMT3b的m RNA表达上调,DNMT3a的蛋白水平上调,PDGFA转录水平和蛋白表达下调,COL1A1、α-SMA转录水平和蛋白水平下调。（7）与过表达miRNA-29b的外泌体和5-Azac共培养的LX-2细胞DNMT3a、DNMT3b的m RNA和蛋白表达下调,PDGFA的m RNA和蛋白表达上调,COL1A1、α-SMA的m RNA和蛋白表达上调。（8）与低表达miRNA-29b的外泌体和5-Azac共培养的LX-2细胞DNMT3a、DNMT3b的m RNA和蛋白表达下调,PDGFA的m RNA和蛋白表达上调,COL1A1、α-SMA的m RNA和蛋白表达上调。（9）与过表达miRNA-29b的外泌体共培养的LX-2细胞PDGFA的DNA启动子区甲基化水平下调,与低表达miRNA-29b的外泌体共培养的LX-2细胞PDGFA的DNA启动子区甲基化水平上调。（10）与过表达miRNA-29b的外泌体+5-Azac共培养的LX-2细胞PDGFA的DNA启动子区甲基化水平下调,与低表达miRNA-29b的外泌体+5-Azac共培养的LX-2细胞PDGFA的DNA启动子区甲基化水平下调。（11）过表达miRNA-29b的外泌体促进LX-2细胞增殖,低表达miRNA-29b的外泌体抑制LX-2细胞的增殖。（12）过表达miRNA-29b的外泌体+5Aazc促进LX-2细胞增殖,低表达miRNA-29b的外泌体+5Azac促进LX-2细胞的增殖。结论:（1）BA患儿外周血外泌体中miRNA-29b高表达,肝组织中PDGFA高表达。（2）过表达miRNA-29b的外泌体使肝星状细胞PDGFA的DNA启动子区低甲基化,促使PDGFA高表达,激活肝星状细胞,参与了BA肝纤维化。
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