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目的：经济发展过程中，化石燃料燃烧、工业废气排放以及植被覆盖率减少等因素共同造成了大气PM2.5浓度的增加。人类主要通过呼吸运动吸入PM2.5，其中支气管具有免疫防御功能，可分泌含免疫球蛋白的黏液清除抗原，支气管表面的纤毛运动以及咳嗽反射有助于异物的排出，此外，支气管还可对吸入的气体起到加湿加温功能。目前，以支气管上皮细胞作为模式细胞的体外研究表明，PM2.5的毒理机制主要包括氧化应激、DNA损伤、炎症信号通路活化以及表观遗传变化等。Toll样受体4（Toll Like Receptor4,TLR4）是先天性免疫系统中的关键信号蛋白，microRNA是表观遗传学的重要内容之一。因此，本研究选择支气管上皮细胞（16Human Bronchial Epithelial,16HBE）作为PM2.5染毒模型，以期阐明TLR4信号通路在PM2.5诱导支气管炎症反应中的变化机理，并以microRNA分子作为研究对象，验证其在PM2.5干预后是否会存在差异性表达以及探讨其对TLR4基因的具体调控机制。
方法：（1）PM2.5样本采集地点为中国河北省石家庄市；激光粒度分析仪检测PM2.5样本的粒度分布；X射线衍射仪鉴定PM2.5主要物相；电感耦合等离子光谱仪检测PM2.5中Al、As及Fe等元素的含量；鲎试剂对PM2.5上清液中的内毒素进行定性分析。（2）不同剂量的PM2.5悬液分别染毒16HBE细胞12、24及48h后，CCK-8细胞计数试剂检测16HBE细胞相对存活率；将细胞置于100μg/mL的PM2.5悬液中染毒24h后，钙黄绿素-AM/碘化丙啶结合细胞内标志物，使用激光共聚焦显微镜采集细胞图像，Hoechst33342染液联合倒置荧光显微镜观察细胞凋亡小体，Wright?s-Giemsa染色以及场发射扫描电子显微镜观察16HBE细胞形态。（3）使用TLR4胞内区抑制剂TAK242（1μg/mL）预处理细胞1h，实时荧光定量PCR检测TAK242预处理前后PM2.5染毒细胞裂解液中白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）与趋化因子8（CXC motif chemokine8,CXCL8）mRNA表达水平，酶联免疫吸附试剂盒检测PM2.5染毒细胞上清液内IL-6与CXCL8蛋白含量。（4）0、25、50、75及100μg/mL的PM2.5悬液处理细胞24小时后，Western blot实验检测TLR4、MyD88、IKK与p-p65蛋白的含量。（5）使用TargetScan、miRWalk及StarBase三大数据库预测TLR4基因的靶向调控microRNA分子，实时荧光定量PCR检测75μg/mL的PM2.5染毒细胞24h后miR-140-5p的表达量；转染miR-140-5p mimic与inhibitor后，Western blot检测TLR4蛋白表达量。（6）双荧光素酶基因报告实验对miR-140-5p与TLR4基因之间的作用位点进行验证。
结果：（1）PM2.5样本中，粒径小于2.5微米的颗粒物累计百分比为94.47%；其主要物相为石英，并含部分方解石；主要元素为Al、As、Fe和Zn；高压灭菌处理后，PM2.5上清液中内毒素效价高于2.5EU/mL。（2）PM2.5暴露时间的延长以及剂量的增加均可造成16HBE细胞相对存活率的下降；100μg/mL的PM2.5悬液染毒细胞24h后，Wright?s-Giemsa染色见16HBE细胞间边界模糊，细胞质溶解，扫描电镜观察见细胞塌陷，颗粒物附着于细胞膜表面，Hoechst33342染色见细胞核破裂成碎片，染色质浓缩，出现明显的凋亡小体形态，AM-PI探针与细胞内标记物结合后，染毒组中死细胞呈现明亮的红色荧光。（3）PM2.5可以从mRNA及蛋白水平刺激16HBE细胞中IL-6与CXCL8两种炎症因子的高表达；使用TAK242预处理细胞1h后，50、75和100μg/mL PM2.5处理组的16HBE细胞上清液中IL-6和CXCL8的蛋白表达降低，差异具有统计学意义。（4）PM2.5以剂量依赖性的方式促进TLR4、MyD88、IKK及p-p65蛋白的表达，当PM2.5悬液浓度大于等于75μg/mL时，TAK242预处理组中TLR4、MyD88、IKK及p-p65蛋白的表达水平均降低。（5）TargetScan、miRWalk及StarBase三大数据库预测TLR4基因的上游靶向调控microRNA分子为miR-140-5p，细胞经75μg/mL的PM2.5染毒处理24h后，miR-140-5p核酸表达量显著降低；miR-140-5p mimic转染组的TLR4蛋白表达量较NC组而言显著降低，inhibitor转染组TLR4的表达增加（P＜0.01）。（6）miR-140-5p的过表达显著降低了TLR4基因野生型报告载体的萤火虫荧光强度（P＜0.01），而TLR4基因突变型报告载体的萤火虫荧光强度几乎不变，表明miR-140-5p通过结合TLR4的3非翻译区（3Untranslated Regions,3UTR）序列以直接负向调控TLR4的表达（结合位置：720-726）。
结论：（1）PM2.5可通过TLR4/NF-κB信号通路诱发支气管上皮细胞的炎症反应，脂多糖可能是触发炎症反应的重要因素。（2）暴露于PM2.5可降低miR-140-5p的表达，过度激活TLR4信号通路并加重细胞的炎症反应。（3）miR-140-5p通过与TLR4的3UTR（5AACCACT3）结合从而抑制TLR4蛋白的表达。
方法：（1）PM2.5样本采集地点为中国河北省石家庄市；激光粒度分析仪检测PM2.5样本的粒度分布；X射线衍射仪鉴定PM2.5主要物相；电感耦合等离子光谱仪检测PM2.5中Al、As及Fe等元素的含量；鲎试剂对PM2.5上清液中的内毒素进行定性分析。（2）不同剂量的PM2.5悬液分别染毒16HBE细胞12、24及48h后，CCK-8细胞计数试剂检测16HBE细胞相对存活率；将细胞置于100μg/mL的PM2.5悬液中染毒24h后，钙黄绿素-AM/碘化丙啶结合细胞内标志物，使用激光共聚焦显微镜采集细胞图像，Hoechst33342染液联合倒置荧光显微镜观察细胞凋亡小体，Wright?s-Giemsa染色以及场发射扫描电子显微镜观察16HBE细胞形态。（3）使用TLR4胞内区抑制剂TAK242（1μg/mL）预处理细胞1h，实时荧光定量PCR检测TAK242预处理前后PM2.5染毒细胞裂解液中白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）与趋化因子8（CXC motif chemokine8,CXCL8）mRNA表达水平，酶联免疫吸附试剂盒检测PM2.5染毒细胞上清液内IL-6与CXCL8蛋白含量。（4）0、25、50、75及100μg/mL的PM2.5悬液处理细胞24小时后，Western blot实验检测TLR4、MyD88、IKK与p-p65蛋白的含量。（5）使用TargetScan、miRWalk及StarBase三大数据库预测TLR4基因的靶向调控microRNA分子，实时荧光定量PCR检测75μg/mL的PM2.5染毒细胞24h后miR-140-5p的表达量；转染miR-140-5p mimic与inhibitor后，Western blot检测TLR4蛋白表达量。（6）双荧光素酶基因报告实验对miR-140-5p与TLR4基因之间的作用位点进行验证。
结果：（1）PM2.5样本中，粒径小于2.5微米的颗粒物累计百分比为94.47%；其主要物相为石英，并含部分方解石；主要元素为Al、As、Fe和Zn；高压灭菌处理后，PM2.5上清液中内毒素效价高于2.5EU/mL。（2）PM2.5暴露时间的延长以及剂量的增加均可造成16HBE细胞相对存活率的下降；100μg/mL的PM2.5悬液染毒细胞24h后，Wright?s-Giemsa染色见16HBE细胞间边界模糊，细胞质溶解，扫描电镜观察见细胞塌陷，颗粒物附着于细胞膜表面，Hoechst33342染色见细胞核破裂成碎片，染色质浓缩，出现明显的凋亡小体形态，AM-PI探针与细胞内标记物结合后，染毒组中死细胞呈现明亮的红色荧光。（3）PM2.5可以从mRNA及蛋白水平刺激16HBE细胞中IL-6与CXCL8两种炎症因子的高表达；使用TAK242预处理细胞1h后，50、75和100μg/mL PM2.5处理组的16HBE细胞上清液中IL-6和CXCL8的蛋白表达降低，差异具有统计学意义。（4）PM2.5以剂量依赖性的方式促进TLR4、MyD88、IKK及p-p65蛋白的表达，当PM2.5悬液浓度大于等于75μg/mL时，TAK242预处理组中TLR4、MyD88、IKK及p-p65蛋白的表达水平均降低。（5）TargetScan、miRWalk及StarBase三大数据库预测TLR4基因的上游靶向调控microRNA分子为miR-140-5p，细胞经75μg/mL的PM2.5染毒处理24h后，miR-140-5p核酸表达量显著降低；miR-140-5p mimic转染组的TLR4蛋白表达量较NC组而言显著降低，inhibitor转染组TLR4的表达增加（P＜0.01）。（6）miR-140-5p的过表达显著降低了TLR4基因野生型报告载体的萤火虫荧光强度（P＜0.01），而TLR4基因突变型报告载体的萤火虫荧光强度几乎不变，表明miR-140-5p通过结合TLR4的3非翻译区（3Untranslated Regions,3UTR）序列以直接负向调控TLR4的表达（结合位置：720-726）。
结论：（1）PM2.5可通过TLR4/NF-κB信号通路诱发支气管上皮细胞的炎症反应，脂多糖可能是触发炎症反应的重要因素。（2）暴露于PM2.5可降低miR-140-5p的表达，过度激活TLR4信号通路并加重细胞的炎症反应。（3）miR-140-5p通过与TLR4的3UTR（5AACCACT3）结合从而抑制TLR4蛋白的表达。