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目的:鲍曼不动杆菌因其强大的定植能力和复杂多变的耐药机制,给临床的抗感染治疗以及遏制院内播散带来了难题。本研究对江苏大学附属医院分离的鲍曼不动杆菌进行了菌落表型、耐药性、临床分布特点和感染相关危险因素的研究,探讨了鲍曼不动杆菌的耐药性与Ⅰ类整合子、插入序列共同区1、复杂性I类整合子、碳青霉烯酶基因和RND外排泵过度表达之间的关系,并分析了抗生素的选择性压力对鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因表达的影响,以期为临床医生合理用药,延缓多重耐药菌株的产生和控制其在医院内传播提供理论依据。方法:1.随机收集2016年7月至2018年6月期间江苏大学附属医院微生物室保存的非重复性鲍曼不动杆菌。采用质谱仪(MALDI-TOF MS)检测鲍曼不动杆菌的指纹图谱;采用VITEK 2-Compact法以及K-B法检测鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物的敏感性;为了分析感染的危险因素,我们利用医院的病历系统收集了菌株分离患者的临床资料。2.采用PCR技术扩增分离菌株的Ⅰ类整合酶基因和ISCR1基因,进一步扩增阳性菌株的可变区,Sanger测序法检测可变区携带的耐药基因盒。对同时携带Ⅰ类整合子和ISCR1的菌株,扩增出Ⅰ类整合子3’-CS与ISCR1 5’-CS之间的序列,用于检测复杂性Ⅰ类整合子,再深入分析复杂性Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株对14种抗菌药物耐药率的差别。根据标本来源选取9株Ⅰ类整合子阳性标本,应用qPCR检测头孢他啶、亚胺培南诱导下Ⅰ类整合酶基因的表达水平,从而分析抗生素选择性压力对Ⅰ类整合酶基因表达的影响。3.采用PCR技术对分离菌株的B类金属酶(NDM-1、VIM、IMP)、D类苯唑西林酶(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58)以及外排基因(adeB、adeJ、adeG、adeR、adeS)进行扩增,再采用qPCR对外排泵阳性菌株进行adeB、adeJ和adeG表达水平的检测,深入分析鲍曼不动杆菌耐药基因的携带情况与菌株耐药性的关系。结果:1.临床分离101株鲍曼不动杆菌,其中多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)71株,非多重耐药鲍曼不动杆菌(NMDRAB)30株。粘液型鲍曼不动杆菌有3株,均为NMDRAB。痰液是标本的主要来源,大部分标本分离自重症监护室,其次是呼吸科。所收集的菌株对14种常见抗菌药物的耐药率较高,替加环素的耐药率最低,为14.85%(15/101),其次是头孢哌酮/舒巴坦,为25.74%(26/101),其余抗菌药物的耐药率均在50%以上。2.共收集85份有效病历资料,其中MDRAB组有60份,NMDRAB组有25份。机械通气、中心静脉置管、留置导尿管和分离菌株前一个月内使用碳青霉烯类抗生素是MDRAB感染的相关危险因素;MDRAB主要集中在ICU,NMDRAB主要分布在内科系统,并且分离MDRAB的患者在分离到菌株前的住院时间以及总的住院时间明显长于分离NMDRAB的患者;在标本类型上,分离出NMDRAB的标本以痰液为主,分离自血液标本的菌株以MDRAB为主;分离出MDRAB的患者的好转率明显低于分离出NMDRAB的患者。3.Ⅰ类整合酶基因阳性菌株有35株,且全部检测到可变区,发现2300 bp(34株)和1800 bp(1株)两种可变区类型,产物经测序比对证实携带的基因盒排列形式分别为aacA4-catB8-aadA1-qacEdelta1和aacC1-aadA1-qacEdelta1-sul。ISCR1阳性菌株有34株,仅两株检出可变区,均为1500 bp,产物经测序比对证实携带PER-1。34株携带Ⅰ类整合子和ISCR1的菌株以串联形式形成复杂性Ⅰ类整合子,阳性菌株对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方新诺明的耐药率显著高于阴性菌株(P<0.05)。4.对于编号为R2、R4、R14、U6、U7和U8的菌株,头孢他啶和亚胺培南能提高I类整合酶基因的表达水平。组间两两比较发现,除了部分菌株低浓度组表达量与对照组之间比较无显著差异(P>0.05),其余各组间比较均具有显著性差异(P>0.05),并且在一定浓度范围内,随着抗生素浓度的增加,Ⅰ类整合酶基因表达量也增加。但是对于编号为B1、B2和B3的菌株,头孢他啶和亚胺培南诱导的Ⅰ类整合酶基因表达水平在各组间的差异并无显著性(P>0.05)。5.71株MDRAB中,NDM-1、IMP和OXA-23的阳性菌株分别为19株、63株和56株;30株NMDRAB仅有3株检测到OXA-23,并未检测到NDM-1和IMP;所有菌株均携带OXA-51,而未检测到VIM、OXA-24和OXA-58。可见MDRAB的NDM-1、IMP和OXA-23携带率明显高于NMDRAB(P<0.05)。6.71株MDRAB中,adeB、adeJ、adeG、adeR和adeS的阳性菌株分别为70株、71株、71株、71株和71株;30株NMDRAB中,adeB、adeJ、adeG、adeR和adeS的阳性菌株分别为6株、30株、27株、17株和20株。MDRAB的adeB、adeG、adeR和adeS基因携带率明显高于NMDRAB(P<0.05)。采用qPCR检测6株MDRAB和4株NMDRAB的外排泵基因表达水平,MDRAB的adeB和adeG表达量显著高于NMDRAB(P<0.05)。结论:1.我院鲍曼不动杆菌耐药情况严重,仅对替加环素保持高度敏感。ICU是MDRAB的重点分离科室。入住ICU、住院时间、机械通气、中心静脉置管、留置导尿管和分离菌株前一个月内使用碳青霉烯类抗生素是MDRAB感染的相关危险因素。2.我院Ⅰ类整合子、ISCR1均存在于MDRAB中,Ⅰ类整合子主要介导氨基糖苷类、季铵盐消毒剂及磺胺类抗生素耐药,ISCR1主要介导β内酰胺类抗生素耐药,并且Ⅰ类整合酶基因在头孢他啶、亚胺培南下诱导下表达增加,在一定浓度范围内,整合酶基因表达量随着抗生素浓度的增加而增加,但是3株血液来源的鲍曼不动杆菌整合酶基因表达量与对照组比较并无明显差异。3.我院Ⅰ类整合子与ISCR1以复杂性整合子形式存在,阳性菌株对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方新诺明的耐药率显著高于阴性菌株。4.B类金属酶(NDM-1、IMP)和D类苯唑西林酶(OXA-23)主要分布在MDRAB中,与鲍曼不动杆菌的耐药性密切相关;外排泵AdeABC主要分布在MDRAB中,而AdeIJK、AdeFGH在鲍曼不动杆菌中较为常见,其中adeABC、adeFGH的高表达介导鲍曼不动杆菌的耐药性。5.3株粘液型鲍曼不动杆菌为NMDRAB,均检测到OXA-51、adeJ、adeG、adeR和adeS,有两株检测到adeB,而OXA-23、OXA-24、OXA-58、NDM-1、VIM和IMP未被检测到。