微生物多糖类絮凝剂MBFA9代谢途径与网络构建研究

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近年来,国内外从事微生物学和环境科学研究的学者对微生物絮凝剂(Microbial Flocculant,MBF)相关技术的研究主要集中在产生絮凝剂的微生物菌种分离筛选与培养、产絮凝剂条件的优化、絮凝产物的化学组成与结构分析、絮凝机理及利用微生物絮凝剂处理废水的研究,有关微生物絮凝剂的代谢途径研究日益增多。然而,对于微生物絮凝剂的代谢网络构建却鲜有报道。因此,本研究以课题组保存的高效絮凝菌A9为研究对象,开展了多糖类微生物絮凝剂A9(又称为絮凝多糖,简称MBFA9)的代谢途径与代谢网络构建研究。  首先,以絮凝菌A9为研究对象,在碳源(葡萄糖)浓度为20g/L、氮源(谷氨酸)浓度为1g/L的发酵培养基中,温度为30℃、摇床转速为150r/min条件下培养48h,当接种量为5%时,菌体生长很快进入对数期,并在培养24h后达到稳定期。随着培养时间延长,多糖产量增加,絮凝率增大,在48h时多糖产量达到4.32g/L,絮凝率达到90.89%,发酵液的絮凝率与多糖产量正相关。菌体生长过程中,发酵液中pH呈线型速度下降,最终呈酸性,因而推测菌体生长代谢过程中会产生酸性物质。  其次,利用液相色谱-质谱联仪(LC/MS)对菌体发酵液的上清液和细胞样本进行筛选分析发现,在菌体生长代谢过程中的主要代谢产物包括多种有机酸(如闪白酸、柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸等)、多种氨基酸(谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等)及糖类物质(葡萄糖6磷酸/葡萄糖1磷酸、麦芽糖、木糖)等。  最后,以A9全基因组测序结果与KEGG数据库比对得到的葡萄糖代谢路径为基础,基于Petri网理论构建絮凝菌A9的葡萄糖代谢网络。利用着色Petri网对应的软件CPN Tools对葡萄糖代谢网络进行定性分析,利用混合函数Petri网对应的软件Cell Illustrator对絮凝菌A9的葡萄糖代谢网络进行定量分析。研究结果表明:由于离散网络的局限性,着色Petri网对葡萄糖代谢网络定性分析不能明确微生物代谢的生物化学反应变化过程;而由Petri网扩展的混合函数Petri网能够准确的表示微生物生物化学反应中反应物与生成物的浓度、反应速率以及反应变化过程。  利用Cell Illustrator软件对絮凝菌A9的葡萄糖代谢网络进行定量模型构建与仿真,确定了A9在利用葡萄糖合成多糖的代谢过程中,对多糖产量产生较大影响的主要中间产物为Glucose-6-phosphate、Glucose-1-phosphate和UDP-glucose,该三种物质的初始量会直接影响多糖的产量,且产生影响作用的大小为:UDP-glucose>Glucose-1-phosphate>Glucose-6-phosphate。
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