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Alternaria oxytropis是课题组分离的小花棘豆（Oxytropis glabra）内生真菌,可产苦马豆素（swainsonine,SW）,SW是吲哚里西啶类生物碱,通过抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ和溶酶体酸性α-甘露糖苷酶使动物中毒。研究发现其他疯草内生真菌、豆类丝核菌（Slafractonia leguminicola）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和罗伯茨绿僵菌（M.robertsii）等真菌也产SW,S.leguminicola、M.anisopliae和M.robertsii中SW合成途径研究较多,而疯草内生真菌中研究很少。在SW合成途径中,推测吡咯啉-5-羧酸还原酶（Pyrroline-5-carboxylate Reductase,P5CR）基因（P5CR）编码蛋白催化△1-哌啶-6-羧酸（△1-piperideine-6-carboxylic acid,P6C）生成哌啶酸（pipecolic acid,PA）;swnH2基因编码2-氧戊二酸Fe依赖性双加氧酶（2-oxoglutarate-dependent nonheme-iron dioxygenases）,催化1-羟基吲哚里西啶（1-hydroxyindolizine）生成1,2-二羟基吲哚里西啶（1,2-dihydroxyindolizine）。本研究用qRT-PCR分析比较不同培养时间（23d、26d、29d、32d）实验组（培养基添加L-PA）和对照组真菌中P5CR基因表达水平,用HPLC-MS检测菌丝体中SW水平,推测P5CR基因对SW合成的影响。克隆SW合成相关swnH2基因及cDNA,预测编码氨基酸序列,进行生信学分析,构建swnH2基因和P5CR基因敲除载体及过表达载体,利用PCR、限制酶切和DNA测序进行验证,为P5CR基因和swnH2基因的SW合成相关功能研究奠定基础,结果如下:1.培养内生真菌OW7.8,分别在23d、26d、29d、32d取样,提取菌丝体的总RNA,利用qRT-PCR分析比较P5CR基因表达水平,实验组真菌P5CR基因表达水平32d>23d>29d>26d,对照组真菌P5CR基因表达水平23d>26d>29d>32d;实验组真菌23d和26d的P5CR基因表达低于对照,29d和32d的P5CR基因表达高于对照,推测生长后期外源添加的L-PA消耗殆尽,P5CR基因表达提高,以维持细胞对L-PA的需求。利用HPLC-MS检测菌丝体的SW水平,发现实验组真菌菌丝体中SW水平高于对照组,故添加L-PA促进SW合成。2.根据A.oxytropis OW7.8基因组序列设计特异性引物,用PCR技术克隆swnH2基因序列,从ATG到TAA长1016bp,有一个内含子,符合GT-AG法则;其开放阅读框（ORF）长957bp,预测编码318aa,与Cook等提交的A.oxytropis序列（KY365741.1）相比,第588位核苷酸发生变异（T→C）,但未改变编码氨基酸-甘氨酸。swnH2基因编码稳定的亲水性蛋白,分子式为C1578H2509N425O481S14,MW为35579.68D,p I为5.16,无跨膜区和信号肽。二级结构以随机卷曲为主,位于细胞质中的可能性大。3.扩增了swnH2基因的5′端及部分上游序列（-329bp～57bp,长386bp,含XmaⅠ和AgeⅠ限制酶切位点）、潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase,hph）（含启动子、终止子、AgeⅠ和SbfⅠ限制酶切位点）、swnH2基因3′端及部分下游序列（601bp～1016bp及下游42bp,长457bp,含SbfⅠ和Eco RⅠ限制酶切位点）,分别进行相应的酶切反应,按顺序依次两两连接成swnH2基因敲除片段,用XmaⅠ和Eco RⅠ酶切swnH2基因敲除片段和p UC19后,连接形成swnH2基因敲除载体,总长4913bp;扩增了swnH2基因cDNA的ORF（含Eco RⅠ和Eco RⅤ限制酶切位点）,与p BARGPE1-Hygro分别经Eco RⅠ和Eco RⅤ限制酶切后连接,构建出swnH2基因过表达载体,总长6949bp,装有gpd A启动子、trp C终止子、hph和Ampr。4.扩增了P5CR基因的5′端（1bp～405bp长405bp,含Bam HⅠ和AgeⅠ限制酶切位点）、hph基因（含启动子、终止子、AgeⅠ和SbfⅠ限制酶切位点）、P5CR基因3′端（760bp～1179bp长420bp,含SbfⅠ和Eco RⅠ限制酶切位点）,分别进行相应的酶切反应,按顺序依次两两连接成P5CR基因敲除片段,用Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切P5CR基因敲除片段和p UC19后,连接形成P5CR基因敲除载体,总长4890bp;扩增了P5CR基因cDNA的ORF（含XmaⅠ和Eco RⅠ限制酶切位点）,与p BARGPE1-Hygro分别经XmaⅠ和Eco RⅠ限制酶切后连接,构建出P5CR基因过表达载体,总长6940bp,装有gpd A启动子、trp C终止子、hph和Ampr。5.优化了OW7.8内生真菌原生质体制备技术,其得率提高到2.85×107个/m L,比前期上升了2个数量级。