单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种常见的革兰氏阳性食源性致病菌。它广泛存在于土壤、奶制品和即食食品中,是近年严重危害公共卫生安全的主要致病菌。老年人、小孩、孕妇等免疫力低下的人群易感染单增李斯特菌,感染后的致死率高达30%。单增李斯特菌能够适应低温、酸性、高渗透压、氧化胁迫等不良环境,造成已消毒食品的二次污染。次氯酸钠是一种常见的消毒剂,它具有强氧化性,能对细胞中重要的蛋白质、核酸以及脂质分子造成氧化损伤。细菌对氧化胁迫的防御是一个复杂的过程,通常伴随着氧化调控因子的参与,包括对氧化剂的解毒作用和对受损细胞的修复作用。此外,大量分布在细胞质中的还原性低分子量巯基蛋白不但能够中和细胞中的氧化剂,还可以保护细胞中重要蛋白不被氧化。在单增李斯特菌中,SOD酶、KAT酶、Lmo1604蛋白具有分解活性氧(ROS)的功能。单增李斯特菌中重要的压力胁迫调控因子sigB对氧化胁迫的调控作用还存在争议,但氧化胁迫调控因子PerR被证明在过氧化氢胁迫下有抗氧化胁迫作用。此外,研究表明,重要的低分子量巯基蛋白谷胱甘肽、NADPH、谷胱甘肽还原酶和Grx共同组成的谷胱甘肽氧化还原系统与硫氧还蛋白还原酶及MetA、MetB蛋白组成的硫氧还原系统在细菌遭遇氧化胁迫的过程中发挥的作用的机制还尚不清楚。在本研究中我们用半致死浓度的次氯酸钠(3 mM)胁迫单增李斯特菌WaX12以及sigB基因缺失株WaX12-ΔsigB,通过观察胁迫中细菌生理生化变化、抗氧化胁迫酶变化以及细胞中重要抗氧化胁迫基因变化情况进一步研究了单增李斯特菌的抗氧化机制。实验结果显示,单增李斯特菌对次氯酸钠有较强的耐受能力,在半致死浓度3 mM仍能存活1 h以上,但浓度超过3 mM后,细菌的存活能力明显下降。次氯酸钠能通过破坏单增李斯特菌的细胞膜入侵细菌造成氧化损伤,引起细菌体内ROS水平上升。结果发现,30 min及以上的胁迫时间下细菌体内的ROS水平更为活跃。而细菌体内的SOD酶在30 min和45 min时酶活较高,KAT酶在45 min时酶活最高。随后在相同程度的致死剂量下,我们比较了次氯酸钠胁迫和H2O2胁迫下细菌溶血活性的变化,实验结果表明,次氯酸钠胁迫下的细菌溶血活性更低。反映了次氯酸钠对细菌毒力的影响作用更大,这可能是与次氯酸钠能够特异靶向含巯基蛋白有关。进一步的研究发现基因perR,trxA,sigB在半致死浓度次氯酸钠胁迫下的表达最为活跃。且随着时间的变化,更多的基因在胁迫后期有较高的表达量。trxA是修复Met蛋白的重要基因,trxA的活跃表达说明Met可能在次氯酸钠胁迫下有重要的作用。随后我们通过人为添加Met观察其抵御氧化胁迫的效果。发现加入Met后细菌的存活率显著提高,且细菌中GSH的含量明显高于未添加Met的细菌。值得注意的是,这一现象在H2O2胁迫作用中并不明显。最后我们通过比较菌野生株WaX12与WaX12-ΔsigB的耐受程度及菌内的活性氧水平来探究单增李斯特菌sigB基因对次氯酸钠胁迫的调控作用。我们发现野生株和sigB基因突变株的表型测定结果显示,野生株比缺失株更耐次氯酸钠胁迫,而且此现象在稳定期更加明显;当胁迫时间达到30 min时,突变株内的活性氧水平增长率比野生株高出19.97%,进一步说明sigB基因对次氯酸钠胁迫有一定的调控作用。RT-PCR结果表明,基因lmo1433、grx和ohrR基因在野生株的表达水平显著高于突变株(P<0.01),而基因lmo0906、lmo2770的表达水平在野生株和缺失株中的差异并不明显。研究表明,单增李斯特菌sigB基因对次氯酸钠胁迫有一定的影响作用,且部分作用可能由激活部分调节机体氧化还原平衡的基因得以实现。