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第一部分：当归多糖逆转5-FU介导骨髓基质细胞成骨/成脂分化失衡的作用及机制研究
骨髓造血抑制和以骨量丢失为主的骨质疏松症是化疗常见的副作用。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）中的干细胞群具有多向分化潜能，既可朝骨系细胞方向分化也可分化为脂肪细胞，成骨/成脂分化平衡是稳定造血微环境成骨细胞龛的必要条件，而成骨细胞龛对维持正向造血调控起着至关重要的作用。既往研究表明氧化应激会导致BMSCs降低成骨分化潜能而朝成脂方向分化，骨髓内成骨细胞及其前体细胞减少，骨髓腔脂肪化，其机制可能与氧化应激促进FOXO与β-catenin结合，激活FOXO转录，抑制β-catenin下游成骨相关因子转录、增强成脂相关因子转录相关。当归多糖（Angelica sinensis Polysaccharides, ASP）是传统中药当归的有效活性成分，具有抗氧化、促造血等功效。课题组前期研究证实ASP可减轻化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对BMSCs的氧化损伤从而延缓造血细胞氧化应激性早衰。ASP对造血的保护机制是否与ASP减轻成骨细胞龛损伤有关目前尚不清楚。本研究以ASP为研究对象，建立人骨髓基质细胞体外药物模型和小鼠在体化疗药物模型，观察ASP对化疗后骨髓造血抑制的逆转作用，探讨具有抗氧化特性的ASP对造血的保护作用是否与其抑制氧化应激维持骨髓基质细胞分化平衡稳定成骨细胞龛的作用相关，并进一步阐明该作用机制是否与ASP调控FOXO/Wnt-β-catenin信号有关。本研究为深入探究ASP的药理作用以及减轻化疗损伤提供理论思路和实验依据。
方法：
1.以具有多向分化潜能的人骨髓基质细胞细胞株（HS-5）为研究对象，应用5-FU、ASP和LiCl建立体外药物模型，探讨当归多糖保护5-FU化疗损伤骨髓基质细胞成骨分化潜能、抑制成脂分化能力的作用，及其对β-catenin信号分子的调控作用。CCK-8检测5-FU对HS-5细胞的抑制率，后续实验选择浓度为25μg/mL的5-FU作用HS-5细胞48 h。实验分为对照组：常规培养；ASP组：常规培养基础上加入100μg/mL的ASP；5-FU组：常规培养基础上加入25μg/mL的5-FU；5-FU+ASP组：常规培养基础上加入浓度为100μg/mL的ASP预处理细胞，6 h后加入25μg/mL5-FU。5-FU+LiCl组：常规培养基础上加入浓度为10 mmol/L的LiCl预处理细胞，6 h后加入25μg/mL5-FU，37℃培养48 h。流式细胞术检测HS-5细胞凋亡；细胞成骨诱导分化后茜素红检测成骨结节，测定成骨分化能力；细胞成脂诱导分化后油红O检测脂滴，测定成脂分化能力；Western blot检测HS-5细胞Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白的表达；RT-qPCR检测Runx2、Osterix、OCN、BMP-2、PPARγ及β-catenin基因的表达。
2.采用化疗药物5-FU建立小鼠体内骨髓抑制模型，研究当归多糖预处理对化疗小鼠骨髓造血抑制和骨髓微环境损伤的保护作用及其机制。C57小鼠随机分为对照组：腹腔注射10 mL/kg/d生理盐水7天；ASP组：连续腹腔注射7天100 mg/kg/d ASP；5-FU组：连续腹腔注射6天10 mL/kg生理盐水，第7天腹腔注射150 mg/kg5-FU；5-FU+ASP组：连续腹腔注射6天100 mg/kg/d ASP，第7天同时腹腔注射100 mg/kg ASP和150 mg/kg5-FU。血细胞计数分析仪检测小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量变化。无菌条件下取C57小鼠双侧股骨和胫骨，制备全骨髓细胞悬液，进行计数。4%多聚甲醛固定股骨，0.5%硝酸脱钙，石蜡切片HE染色光学显微镜下检测小鼠股骨形态学改变；免疫组化检测骨髓成骨细胞SDF-1因子表达。全骨髓法培养小鼠骨髓基质细胞，流式细胞术以及DCFH-DA荧光检测骨髓基质细胞内ROS水平，TBA法、WST-8法、可见光法分别检测骨髓基质细胞MDA含量， MnSOD和CAT活力；Western blot和RT-qPCR法检测骨髓基质细胞成骨分化与成脂分化的相关指标以及FOXO与Wnt通路中关键信号分子。
3.建立小鼠骨髓基质细胞体外药物模型检测成骨成脂分化能力。取C57小鼠股骨和胫骨骨髓细胞进行体外全骨髓细胞培养，贴壁传代至第三代时，细胞分为对照组：常规培养；ASP组：常规培养加入100μg/mL的ASP；5-FU组：常规培养加入25μg/mL5-FU；5-FU+ASP组：ASP预培养细胞6 h，再加入25μg/mL5-FU。37℃，5%CO2条件下培养48 h，进行成骨成脂诱导分化，检测成骨成脂分化能力。
结果：
1. ASP可以减少5-FU诱导后HS-5细胞凋亡；ASP逆转5-FU对HS-5细胞成骨分化潜能的抑制：成骨诱导分化后成骨结节明显增多，促进成骨分化因子Runx2蛋白的表达，促进Runx2、Osterix、OCN和BMP-2成骨分化基因转录；ASP减轻5-FU对HS-5细胞成脂分化的促进作用：成脂诱导分化后脂滴明显减少，成脂分化因子PPARγ蛋白和基因表达均明显下降。ASP减轻5-FU对β-catenin表达的抑制，上调β-catenin的表达。
2. ASP减轻5-FU诱发的小鼠骨髓抑制：ASP提升5-FU作用后外周血红细胞、白细胞和血小板数量，并加快外周血象恢复进程；ASP减轻5-FU作用后骨髓腔细胞数量下降，抑制骨髓脂肪化。ASP阻止5-FU诱导后小鼠股骨骨小梁稀疏、变短、间隙增大等损伤，促进股骨骨小梁长度以及宽度的恢复；ASP逆转骨髓内成骨细胞数量及造血细胞趋化因子SDF-1的表达。
3. ASP可以拮抗5-FU对小鼠骨髓基质细胞抗氧化能力的削弱，增加细胞抗氧化能力，增强细胞 MnSOD、CAT活性，减少胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和脂质氧化标志物MDA含量。
4.在小鼠骨髓基质细胞体外药物模型中，ASP预处理可以纠正5-FU介导的小鼠骨髓基质细胞分化失衡，诱导分化后的成骨结节显著性增多，脂滴明显减少。上调骨髓基质细胞成骨分化能力、下调成脂分化，成骨相关因子Runx2、OCN、BMP-2以及Osterix表达升高，而PPARγ表达降低。
5.在体实验骨髓基质细胞的 Western blot结果表明，ASP可以抑制5-FU对FOXO1的激活，ASP促进FOXO1的磷酸化，抑制FOXO1及其下游Bim和P27-Kip1的表达；ASP逆转5-FU介导的FOXO1对Wnt通路关键蛋白β-catenin的竞争性抑制作用，上调β-catenin、p-GSK-3β和Lef-1蛋白的表达，抑制GSK-3β的表达。
结论：
1. ASP可以逆转5-FU所致的骨髓抑制，促进骨髓造血功能恢复。
2. ASP可以减轻5-FU诱发的骨髓基质细胞氧化应激，增强骨髓基质细胞成骨分化能力，下调成脂分化水平，保持骨髓基质成骨/成脂分化平衡，维持成骨细胞龛稳定，促进造血。
3. ASP维持骨髓基质细胞分化平衡的机制可能与减轻氧化应激，下调FOXO1进而激活Wnt/β-catenin信号，上调其下游成骨转录因子、抑制成脂转录因子有关。
第二部分：人参皂苷Rg1通过FOXO1转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病
肝细胞衰老与多种慢性肝脏疾病的发展有关。衰老伴随非酒精性脂肪肝病(Non Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)发生，了解衰老驱动 NAFLD的潜在机制和寻找有效的治疗方法来限制慢性肝脏疾病的发生与发展具有重要意义。人参是一种广泛用于治疗包括肝脏疾病在内的各种疾病的中药，有抗衰老和抗氧化等特性，Rg1是人参最有效的活性成分，本实验探究 Rg1对衰老驱动慢性肝病的潜在保护作用及其相关机制。
方法：
1.40只SPF级别健康C57BL/6雄鼠随机分为四组：对照组：腹腔注射10 mL/kg生理盐水；Rg1组：腹腔注射42天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1；Rg1+D-gal组：连续腹腔注射16天浓度为120 mg/kg/d的D-gal，第17天起连续腹腔注射26天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1；D-gal组：腹腔注射小鼠42天浓度为120 mg/kg/d的D-gal。称量小鼠体重以及肝脏湿重，计算各组小鼠肝脏指数；收集血清，微板法检测血清ALT和AST含量；制备肝脏匀浆，分别检测各组小鼠MDA、SOD和CAT含量。
2.制备冰冻切片SA-β-gal染色检测肝脏衰老情况，油红O染色观察肝脏中的脂肪。透射电子显微镜观察肝脏超微结构，HE染色、高碘酸希夫染色和TUNEL凋亡染色对肝脏进行组织病理学研究。
3.酶联免疫吸附测定肝脏匀浆中炎症因子 IL-1β、IL-6和 MCP-1的表达，免疫组织化学染色法检测肝脏 FOXO1因子的表达，Western blot检测肝脏组织中P53、P21、FOXO1、p-FOXO1、Bcl-2、Bax和Bim蛋白的表达。
结果：
1. Rg1减轻D-gal引起的肝损伤，下调肝脏指数，逆转D-gal诱导的血清ALT和AST异常升高。
2. Rg1降低D-gal诱导的小鼠肝细胞衰老相关标志物SA-β-gal和衰老相关蛋白P53、P21蛋白的表达；Rg1减轻肝脂肪变性、肝葡萄糖生成减少、水样变性，减少衰老相关分泌表型（ senescence-associated secretory phenotype，SASP）包括IL-1β、IL-6和MCP-1炎症因子分泌和淋巴细胞浸润。
3. Rg1抑制FOXO1磷酸化的急剧升高，维持D-gal作用后的肝脏FOXO1蛋白表达水平，增强FOXO1靶向超氧化物歧化酶（SOD）以及过氧化氢酶（CAT）活性，降低脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的含量。
结论：
1. Rg1具有保持肝脏FOXO1活性的药理作用，增强肝细胞抗氧化能力。
2. Rg1降低SASP抑制炎症，维持肝脏代谢稳态，保护肝脏免于衰老引起的肝脏脂肪变性疾病。
骨髓造血抑制和以骨量丢失为主的骨质疏松症是化疗常见的副作用。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）中的干细胞群具有多向分化潜能，既可朝骨系细胞方向分化也可分化为脂肪细胞，成骨/成脂分化平衡是稳定造血微环境成骨细胞龛的必要条件，而成骨细胞龛对维持正向造血调控起着至关重要的作用。既往研究表明氧化应激会导致BMSCs降低成骨分化潜能而朝成脂方向分化，骨髓内成骨细胞及其前体细胞减少，骨髓腔脂肪化，其机制可能与氧化应激促进FOXO与β-catenin结合，激活FOXO转录，抑制β-catenin下游成骨相关因子转录、增强成脂相关因子转录相关。当归多糖（Angelica sinensis Polysaccharides, ASP）是传统中药当归的有效活性成分，具有抗氧化、促造血等功效。课题组前期研究证实ASP可减轻化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对BMSCs的氧化损伤从而延缓造血细胞氧化应激性早衰。ASP对造血的保护机制是否与ASP减轻成骨细胞龛损伤有关目前尚不清楚。本研究以ASP为研究对象，建立人骨髓基质细胞体外药物模型和小鼠在体化疗药物模型，观察ASP对化疗后骨髓造血抑制的逆转作用，探讨具有抗氧化特性的ASP对造血的保护作用是否与其抑制氧化应激维持骨髓基质细胞分化平衡稳定成骨细胞龛的作用相关，并进一步阐明该作用机制是否与ASP调控FOXO/Wnt-β-catenin信号有关。本研究为深入探究ASP的药理作用以及减轻化疗损伤提供理论思路和实验依据。
方法：
1.以具有多向分化潜能的人骨髓基质细胞细胞株（HS-5）为研究对象，应用5-FU、ASP和LiCl建立体外药物模型，探讨当归多糖保护5-FU化疗损伤骨髓基质细胞成骨分化潜能、抑制成脂分化能力的作用，及其对β-catenin信号分子的调控作用。CCK-8检测5-FU对HS-5细胞的抑制率，后续实验选择浓度为25μg/mL的5-FU作用HS-5细胞48 h。实验分为对照组：常规培养；ASP组：常规培养基础上加入100μg/mL的ASP；5-FU组：常规培养基础上加入25μg/mL的5-FU；5-FU+ASP组：常规培养基础上加入浓度为100μg/mL的ASP预处理细胞，6 h后加入25μg/mL5-FU。5-FU+LiCl组：常规培养基础上加入浓度为10 mmol/L的LiCl预处理细胞，6 h后加入25μg/mL5-FU，37℃培养48 h。流式细胞术检测HS-5细胞凋亡；细胞成骨诱导分化后茜素红检测成骨结节，测定成骨分化能力；细胞成脂诱导分化后油红O检测脂滴，测定成脂分化能力；Western blot检测HS-5细胞Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白的表达；RT-qPCR检测Runx2、Osterix、OCN、BMP-2、PPARγ及β-catenin基因的表达。
2.采用化疗药物5-FU建立小鼠体内骨髓抑制模型，研究当归多糖预处理对化疗小鼠骨髓造血抑制和骨髓微环境损伤的保护作用及其机制。C57小鼠随机分为对照组：腹腔注射10 mL/kg/d生理盐水7天；ASP组：连续腹腔注射7天100 mg/kg/d ASP；5-FU组：连续腹腔注射6天10 mL/kg生理盐水，第7天腹腔注射150 mg/kg5-FU；5-FU+ASP组：连续腹腔注射6天100 mg/kg/d ASP，第7天同时腹腔注射100 mg/kg ASP和150 mg/kg5-FU。血细胞计数分析仪检测小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量变化。无菌条件下取C57小鼠双侧股骨和胫骨，制备全骨髓细胞悬液，进行计数。4%多聚甲醛固定股骨，0.5%硝酸脱钙，石蜡切片HE染色光学显微镜下检测小鼠股骨形态学改变；免疫组化检测骨髓成骨细胞SDF-1因子表达。全骨髓法培养小鼠骨髓基质细胞，流式细胞术以及DCFH-DA荧光检测骨髓基质细胞内ROS水平，TBA法、WST-8法、可见光法分别检测骨髓基质细胞MDA含量， MnSOD和CAT活力；Western blot和RT-qPCR法检测骨髓基质细胞成骨分化与成脂分化的相关指标以及FOXO与Wnt通路中关键信号分子。
3.建立小鼠骨髓基质细胞体外药物模型检测成骨成脂分化能力。取C57小鼠股骨和胫骨骨髓细胞进行体外全骨髓细胞培养，贴壁传代至第三代时，细胞分为对照组：常规培养；ASP组：常规培养加入100μg/mL的ASP；5-FU组：常规培养加入25μg/mL5-FU；5-FU+ASP组：ASP预培养细胞6 h，再加入25μg/mL5-FU。37℃，5%CO2条件下培养48 h，进行成骨成脂诱导分化，检测成骨成脂分化能力。
结果：
1. ASP可以减少5-FU诱导后HS-5细胞凋亡；ASP逆转5-FU对HS-5细胞成骨分化潜能的抑制：成骨诱导分化后成骨结节明显增多，促进成骨分化因子Runx2蛋白的表达，促进Runx2、Osterix、OCN和BMP-2成骨分化基因转录；ASP减轻5-FU对HS-5细胞成脂分化的促进作用：成脂诱导分化后脂滴明显减少，成脂分化因子PPARγ蛋白和基因表达均明显下降。ASP减轻5-FU对β-catenin表达的抑制，上调β-catenin的表达。
2. ASP减轻5-FU诱发的小鼠骨髓抑制：ASP提升5-FU作用后外周血红细胞、白细胞和血小板数量，并加快外周血象恢复进程；ASP减轻5-FU作用后骨髓腔细胞数量下降，抑制骨髓脂肪化。ASP阻止5-FU诱导后小鼠股骨骨小梁稀疏、变短、间隙增大等损伤，促进股骨骨小梁长度以及宽度的恢复；ASP逆转骨髓内成骨细胞数量及造血细胞趋化因子SDF-1的表达。
3. ASP可以拮抗5-FU对小鼠骨髓基质细胞抗氧化能力的削弱，增加细胞抗氧化能力，增强细胞 MnSOD、CAT活性，减少胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和脂质氧化标志物MDA含量。
4.在小鼠骨髓基质细胞体外药物模型中，ASP预处理可以纠正5-FU介导的小鼠骨髓基质细胞分化失衡，诱导分化后的成骨结节显著性增多，脂滴明显减少。上调骨髓基质细胞成骨分化能力、下调成脂分化，成骨相关因子Runx2、OCN、BMP-2以及Osterix表达升高，而PPARγ表达降低。
5.在体实验骨髓基质细胞的 Western blot结果表明，ASP可以抑制5-FU对FOXO1的激活，ASP促进FOXO1的磷酸化，抑制FOXO1及其下游Bim和P27-Kip1的表达；ASP逆转5-FU介导的FOXO1对Wnt通路关键蛋白β-catenin的竞争性抑制作用，上调β-catenin、p-GSK-3β和Lef-1蛋白的表达，抑制GSK-3β的表达。
结论：
1. ASP可以逆转5-FU所致的骨髓抑制，促进骨髓造血功能恢复。
2. ASP可以减轻5-FU诱发的骨髓基质细胞氧化应激，增强骨髓基质细胞成骨分化能力，下调成脂分化水平，保持骨髓基质成骨/成脂分化平衡，维持成骨细胞龛稳定，促进造血。
3. ASP维持骨髓基质细胞分化平衡的机制可能与减轻氧化应激，下调FOXO1进而激活Wnt/β-catenin信号，上调其下游成骨转录因子、抑制成脂转录因子有关。
第二部分：人参皂苷Rg1通过FOXO1转录因子预防D-半乳糖诱导的小鼠脂肪性肝病
肝细胞衰老与多种慢性肝脏疾病的发展有关。衰老伴随非酒精性脂肪肝病(Non Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)发生，了解衰老驱动 NAFLD的潜在机制和寻找有效的治疗方法来限制慢性肝脏疾病的发生与发展具有重要意义。人参是一种广泛用于治疗包括肝脏疾病在内的各种疾病的中药，有抗衰老和抗氧化等特性，Rg1是人参最有效的活性成分，本实验探究 Rg1对衰老驱动慢性肝病的潜在保护作用及其相关机制。
方法：
1.40只SPF级别健康C57BL/6雄鼠随机分为四组：对照组：腹腔注射10 mL/kg生理盐水；Rg1组：腹腔注射42天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1；Rg1+D-gal组：连续腹腔注射16天浓度为120 mg/kg/d的D-gal，第17天起连续腹腔注射26天浓度为40 mg/kg/d的人参皂苷Rg1；D-gal组：腹腔注射小鼠42天浓度为120 mg/kg/d的D-gal。称量小鼠体重以及肝脏湿重，计算各组小鼠肝脏指数；收集血清，微板法检测血清ALT和AST含量；制备肝脏匀浆，分别检测各组小鼠MDA、SOD和CAT含量。
2.制备冰冻切片SA-β-gal染色检测肝脏衰老情况，油红O染色观察肝脏中的脂肪。透射电子显微镜观察肝脏超微结构，HE染色、高碘酸希夫染色和TUNEL凋亡染色对肝脏进行组织病理学研究。
3.酶联免疫吸附测定肝脏匀浆中炎症因子 IL-1β、IL-6和 MCP-1的表达，免疫组织化学染色法检测肝脏 FOXO1因子的表达，Western blot检测肝脏组织中P53、P21、FOXO1、p-FOXO1、Bcl-2、Bax和Bim蛋白的表达。
结果：
1. Rg1减轻D-gal引起的肝损伤，下调肝脏指数，逆转D-gal诱导的血清ALT和AST异常升高。
2. Rg1降低D-gal诱导的小鼠肝细胞衰老相关标志物SA-β-gal和衰老相关蛋白P53、P21蛋白的表达；Rg1减轻肝脂肪变性、肝葡萄糖生成减少、水样变性，减少衰老相关分泌表型（ senescence-associated secretory phenotype，SASP）包括IL-1β、IL-6和MCP-1炎症因子分泌和淋巴细胞浸润。
3. Rg1抑制FOXO1磷酸化的急剧升高，维持D-gal作用后的肝脏FOXO1蛋白表达水平，增强FOXO1靶向超氧化物歧化酶（SOD）以及过氧化氢酶（CAT）活性，降低脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的含量。
结论：
1. Rg1具有保持肝脏FOXO1活性的药理作用，增强肝细胞抗氧化能力。
2. Rg1降低SASP抑制炎症，维持肝脏代谢稳态，保护肝脏免于衰老引起的肝脏脂肪变性疾病。