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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是一种革兰氏阴性菌。HPS是猪上呼吸道的一种常在菌,但在特定条件下能够侵入机体并通过血脑屏障引起猪脑膜炎的发生。菌毛是分布在细菌周身细而短的丝状物,通过电子显微镜可以观察到大多数革兰氏阴性菌表面存在该结构。Ⅳ型菌毛作为菌毛的一种,其在粘附和侵入、DNA摄取及介导细菌穿过血脑屏障等方面发挥功能。本研究克隆和分析了HPS强毒分离株SH0165以及17株参考菌株中Ⅳ型菌毛操纵子的序列,比较了各结构基因的保守性和同源性,为研究不同的功能位点与菌毛致病性的关系奠定基础。尝试使用多种培养条件培养SH0165菌株,成功观察到猪体内分离的SH0165存在菌毛结构,并通过VWestern blot验证了该结果。尝试对菌毛基因簇中的菌毛素基因pilA进行缺失,为进一步实现菌毛的体外表达及研究菌毛的功能提供帮助。本论文具体研究内容如下：1、克隆并分析了菌毛操纵子的序列参照HPS SH0165全基因组序列,设计引物并克隆Ⅳ型菌毛操纵子序列,通过序列分析发现操纵子的结构基因由四个ORF组成,分别为pilA、pilB、pilC和pilD,分别编码170、462、399和222个氨基酸,通过基因序列分析发现,HPS17株标准菌株中pilA的序列同源性在85%以上,而且基因的保守性较高,而标准菌株pilB、pilC和pilD的序列同源性均在40%-50%左右。对其蛋白序列进行比对分析,发现pilA基因与相近种属的有关基因相似性较高。另外,PilA蛋白羧基端拥有相对保守的半胱氨酸残基,该位点能够形成二硫键并产生一个环形结构,在Ⅳ型菌毛发挥功能时起到重要作用,而且是主要的抗原决定部位。2、PilA蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备以SH0165菌株的基因组DNA为模板,设计引物扩增pilA片段,将pilA与pET-28a连接转化E.coli/BL21(DE3)菌株并进行原核表达。利用透析的方法对表达在包涵体中的PilA蛋白进行纯化,利用纯化好的蛋白免疫BALB/c鼠进行多克隆抗体的制备。间接ELISA和Western-blot分析表明抗体特异性良好,其中较高的效价为1：51200,可用于后续研究使用。3、菌毛在不同环境下的表达情况本研究尝试使用多种培养基来实现菌毛的体外表达,如使用LB培养基、巧克力琼脂培养基、鲜血琼脂培养基以及化学成分限定培养基来培养HPS,但通过电镜观察均未观察到菌毛的存在。使用细胞与细菌共培养的方法,试图诱导HPS菌毛的表达,未能达到预期结果。另外,将HPS在鸡胚绒毛尿囊膜上传代后进行细菌的电镜观察,也未能观察到菌毛的存在。用副猪嗜血杆菌感染健康猪,采集感染猪血清及各发病组织,从胸水中分离的细菌通过电子显微镜,观察到了菌毛结构的存在。4、Western blot验证PilA为体内诱导表达蛋白将纯化好的PilA蛋白制备样品,分别用康复猪血清、灭活苗免疫猪血清及健康猪血清做为一抗来进行Western blot实验,在用康复猪血清做为一抗检测蛋白PilA时,可以在大约20kD的位置看到一条清晰的条带,而用灭活苗免疫猪血清和健康猪血清做为一抗进行检测时,在相同的位置没有条带出现。另外,利用PilA抗血清做为一抗来验证体外培养的HPS发现,SH0165菌株在实验室培养条件下并未检测出有PilA蛋白的表达,综上所述,PilA蛋白只有在宿主体内才能表达,属于体内诱导表达蛋白。5、构建pilA基因的缺失突变株以温敏型穿梭质粒pSHK3Ts为骨架,从SH0165基因组上克隆pilA基因的上下游同源臂,连接到质粒骨架上,构建重组质粒pSHK3TS-UD。利用电转化的方法将重组质粒转入SH0165菌株中,通过温度敏感和同源重组原理筛选缺失突变株。经过酶切鉴定,重组质粒构建正确,而且能够成功电转化入SH0165菌株中,筛选了10000个转化子后仍未得到缺失突变株。