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胚乳后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA蛋白)是一类在种子胚胎发育晚期丰富聚集的蛋白质。LEA蛋白是一类多家族蛋白,并在生物界广泛分布。LEA基因除在正常种子发育后期丰富表达外,高盐、干旱和冷害等环境因素及脱落酸(ABA)等植物激素也可诱导一些LEA基因在叶片、根等植物营养器官中表达。研究表明,LEA蛋白与植物抗逆密切相关,LEA基因的过表达能提高受体植株的耐盐、耐干旱能力。烟草作为一种重要的模式植物,普遍用于研究其他植物的LEA基因的功能,但其自身的LEA基因的相关研究尚未见报道。随着烟草基因组测序工作的完成,挖掘信息,研究烟草LEA基因,探索其功能,对植物抗逆基础研究领域具有重要意义,并有望通过遗传育种手段提高烟草的抗旱耐盐性。本研究结合生物信息学方法和分子克隆手段从烟草中克隆到一个LEA基因,命名为NtLEA1,并通过生物信息学分析、逆境胁迫的表达分析和转基因烟草植株表型分析,来初步探索NtLEA1基因的功能,主要工作内容及成果如下:①结合生物信息学分析方法,用番茄的LEA基因序列同源检索烟草EST数据库,EST序列拼接得到预测的烟草LEA基因,通过分子克隆获得目的基因的ORF编码区序列,总长度为501bp,GC含量为51.5%,与番茄LEA基因序列相似度达78%,命名为NtLEA1基因。该基因编码166个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量为17.3551kD,等电点为8.62,不稳定系数为15.71,亲水性总平均值为-1.103。保守结构域预测NtLEA1蛋白含有7个串联重复的11-氨基酸保守基序,属于第三组LEA蛋白。生物信息学分析表明NtLEA1蛋白二级结构以α螺旋结构为主,具有高亲水性和热稳定性。启动子序列分析表明NtLEA1基因上游序列中含1个胚乳表达元件(Skn-1motif)、2个ABA应答元件(ABRE)、1个MeJA响应元件(CGTCA-motif)、1个水杨酸响应元件(TCA-element)、1个高温胁迫应答元件(HSE)、1个干旱应答元件(MBS)及2个光调控元件(Box4)。②半定量PCR分析表明NtLEA1基因的表达受PEG模拟干旱胁迫、ABA、盐胁迫的诱导,几乎不受冷胁迫的诱导,其中受盐胁迫诱导最为强烈,由此推断NtLEA1基因与烟草抗逆相关。③为进一步探索NtLEA1基因的功能,本研究构建了一个由CaMV35S启动子驱动的植物双元表达载体pCXSN-NtLEA1,并由根瘤农杆菌LBA4404介导通过叶盘转化法转化烟草,经抗性筛选、35S启动子和潮霉素抗性基因hpt的PCR鉴定及相对荧光定量PCR分析确定获得了NtLEA1过表达转基因株系(OEX-L1L4)。④T0代NtLEA1过表达烟草植株抗盐性分析表明:1.5%NaCl溶液胁迫处理培养12天后,转基因株系(OEX-L1L2)叶片仍较饱满,颜色翠绿,而对照植株(WT)叶片开始发黄萎缩;120mm/L NaCl胁迫培养20天,NtLEA1过表达株系(OEX-L2)组培苗的生根率(80%)高于野生型对照株系的生根率(60%);1.5%NaCl溶液胁迫3d后,过表达植株(OEX-L2)和对照植株(WT)幼苗叶片的总叶绿素含量均较处理前有所下降,但转基因植株的下降率(16.3%)明显低于对照植株(28.6%),由此推断NtLEA1基因的过表达提高了转基因烟草植株的抗盐能力。