【摘 要】
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目的:本课题组通过采用重组腺病毒高表达载体系统pAdEasy System为基础,通过改造pAdEasy-1野生纤毛结构,使其失去重组腺病毒基因治疗载体的天然属性,具备HBV的嗜肝性,拟构建
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目的:本课题组通过采用重组腺病毒高表达载体系统pAdEasy System为基础,通过改造pAdEasy-1野生纤毛结构,使其失去重组腺病毒基因治疗载体的天然属性,具备HBV的嗜肝性,拟构建出用于肝脏靶向性基因治疗的重组腺病毒载体。方法:以重组腺病毒系统pAdEasy System为基础,用体内同源重组的方式,将含HBV嗜肝细胞段的编码基因(PreS1的21-47aa)的Fiber DNA片段置换野生型pAdEasy-1的fiber DNA片段,建出重组骨架质粒pAdEasy-1-Fiber,再用BJ5183/pAdEasy-1-Fiber感受态细胞与穿梭质粒pAdTrack-CMV同源重组成病毒质粒pAd-Fiber,用PacI酶切后质粒pAd-Fiber经HEK293细胞包装后生成病毒载体rAd-Fiber。用rAd-Fiber感染多种细胞株检验rAd-Fiber对肝细胞的嗜向性。结果:用含HBV嗜肝细胞段的编码基因(PreS1的21-47aa)的Fiber DNA片段置换野生型pAdEasy-1的fiber DNA片段经测序显示质粒pAdEasy-1-Fiber基因序列完全正确;病毒质粒pAd-Fiber转染HEK293细胞,7天后在倒置显微镜下观察其表达的绿色荧光蛋白,提示rAd-Fiber能正常生成;以rAd-Fiber为模板行PCR检测能提取经我们同源重组上的基因片段Fiber;用免疫印迹法检测提取rAd-Fiber感染HEK293细胞后的蛋白,我们能检测到目标PreS1多肽的表达;用经改造过的载体rAd-Fiber感染不同的细胞,观察后显示对肝癌细胞具有相对较强的嗜向性。结论:用含HBV嗜肝细胞段的编码基因(PreS1的21-47aa)的Fiber DNA片段置换野生型pAdEasy-1的fiber DNA片段,改造pAdEasy System野生纤毛结构,经HEK293细胞包装生成的重组腺病毒基因治疗载体rAd-Fiber,通过体外细胞实验显示对肝癌细胞具有相对嗜向性。
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