禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的传染性疾病。AIV不仅感染禽类,部分亚型还能感染人,具有公共卫生意义。AIV分为16个HA亚型和9个NA亚型。基于AIV亚型众多,亚型内又分不同亚群,再加上基因突变、重组和重排,使得AIV变异极快,导致毒株的致病性有很大差别。确定是何种亚型病毒引起疫情,是预防、控制禽流感的前提条件。WHO推荐的病毒亚型鉴定的金标方法是血凝抑制(HA-HI)试验及神经氨酸酶抑制(NA-NI)试验。早期从国外引进参考抗原及血清,对亚型鉴定有一定帮助,但是随着病毒的进化,这些国外的参考抗原及血清已经不能及时准确地鉴定我国的现有病毒。目前国内使用的禽流感诊断血清是全病毒制备的全血清。全血清包含多种抗体成分,特异性差,全血清之间存在交叉,不能确切地鉴定亚型,这为临床诊断带来干扰。制备禽流感的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)特异性单因子血清,使得病毒亚型鉴定更为准确,快捷,方便。本实验采用表达HA基因及NA基因的真核表达重组质粒免疫SPF鸡制备单因子血清。选取16个HA亚型的共29株代表毒株,人工合成其HA基因。选取9个NA亚型的共10株代表毒株,人工合成其NA基因。用鸡体偏嗜的密码子替换原序列。在序列ORF前添加Kozak序列(-GCCGCC-)。以真核表达质粒pCAGGS为载体,构建HA基因及NA基因的真核表达重组质粒。经酶切鉴定及体外瞬时表达检测证实重组质粒结构正确,能正常表达目的蛋白。大量提取纯化重组质粒,以200μg,200μL每只的剂量肌肉接种SPF鸡,四周后收获血清。HA单因子血清通过血凝-血凝抑制试验(HA-HI)检测,抗体滴度达到6log2及以上水平,灵敏度高。交叉HA-HI试验结果显示各亚型血清之间无明显交互现象,特异性强。重点分析了H5亚型及H9亚型单因子血清。针对国内流行的H5N1亚型禽流感病毒野鸟亚群(WB)、南方亚群(ST)及山西亚群(SX)的4株代表毒株制备了单因子血清,与H5亚型商品血清对比,单因子血清特异性强,能区分抗原性差异大的病毒。针对1996年至2008年国内流行H9N2病毒,选择了6株代表病毒,制备了单因子血清,单因子血清较全病毒血清特异性强,灵敏度高。NA单因子血清经全量法及微量法NI实验检测,证实血清中含有NA抗体。与全病毒制备的血清比较发现,NA基因单因子血清各亚型之间无交互反应,特异性好。本研究构建的29株HA基因真核表达重组质粒及10株NA基因真核表达重组质粒,表达效果好,可用于DNA疫苗研究。制备的单因子血清可用于临床诊断及病毒抗原性分析及其他试验研究。