人骨髓间充质干细胞(human marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs)为来自人类骨髓的多能成体干细胞。因为其具有多向分化的潜力,同时移植时没有排斥反应这些特质,决定了其在组织工程的修复组织缺损具有了非常重要的临床应用价值。由于hBMSCs的诸多优点,近年来其在骨缺损修复中的应用与构建成为研究的热点。外伤、肿瘤、先天畸形等是引起颌面部骨组织缺损的主要原因,不仅造成颜面畸形,同时引起功能障碍如语言、咀嚼、呼吸,对患者的生理和心理造成极大的困扰。因此,修复骨组织的缺损同时需兼顾两方面：功能与美观。传统的骨缺损修复方法一般分三类：人工骨移植、自体骨移植、同种异体骨移植。上述修复骨缺损的方法因具有各自的弊端,效果欠佳。然而,构建组织工程骨的方法,为骨缺损的修复提供了一个避免以上弊端的新的研究方向。骨组织工程研究方向主要为种子细胞、细胞外基质材料以及生长和分化因子。组织工程活性成分的主要来源,而其中最重要的,也是最基础的就是选择种子细胞。目前,在种子细胞的选择应用上,应用最广泛的是hMSCs。最近研究发现,LncRNA与人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)两者之间在成骨分化方面可能存在某种联系。成骨细胞在发育分化过程中,特定基因严格按照特定的顺序激活与关闭,控制着成骨分化的不同阶段。而成骨分化的早期决定了未来细胞的发展。因此,影响成骨分化早期的LncRNA对hBMSCs成骨的调控机制,将为颌面部骨组织缺损的修复提供一个新的研究方向。本研究将进行具体的探讨来确定两者的关系。近年来研究发现,间充质干细胞的成骨分化受多种分子机制调控,如生长因子(Wnt家族、骨形态发生蛋白家族)、转录因子(β-cateni、 Runx2)和miRNA等。以上机制的研究已经有了显著的进展,大量文献也已经报导过。近期有学者发现,LncRNA与MSCs的成骨过程中具有一定的联系,尤其与人类的成骨的过程息息相关。LncRNA的转录本大于200bp,通常被称为非编码RNA。他们不直接参与蛋白的编码,但是形成复杂的空间结构,在转录水平或转录后水平对特定基因进行调控与修饰。随着检测技术的进步如基因芯片、RNA测序等,大量的LncRNA被鉴定并证实在基因转录及转录后层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程的调控。已有的研究显示LncRNA参与调控神经元分化、肌分化、表皮分化、成脂分化。LncRNA通过影响多能标志物转录因子从而实现调控干细胞的生长分化过程。同样,hBMSCs成骨分化的发生与发展也是由LncRNA调控相关成骨基因的转录或转录后修饰来实现。而且,LncRNA在成骨诱导分化不同时期的表达水平具有明显的改变,提示LncRNA成骨与破骨平衡中起着动态的调控作用。目前,由于LncRNA的研究时间短,关于其在hBMSCs成骨分化方面的研究报道较少,且主要集中于单个LncRNA的研究,因此此领域有很大的研究前景。本实验我们利用人类LncRNA表达谱芯片检测技术筛选LncRNA。筛选出在hMSCs成骨诱导分化前,与成骨诱导分化后,表达差异呈现倍数变化数量的LncRNA。同时选取其中表达量差异较大的LncRNA通过构建慢病毒干扰及过表达载体进行成骨方面的功能验证。本实验将分为以下3个部分：第一章人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的鉴定：研究目的：人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)为来自人类骨髓的多能成体干细胞,多向分化潜力及无移植排斥反应决定了其在组织工程再生领域具有重要的临床应用价值例。由于hBMSCs近年来在颌面部骨组织缺损修复中逐渐成为研究热点,而成骨分化的早期决定了未来细胞的发展,同时已有文献报道指出,LncRNA与间充质干细胞(MSCs)发育过程是存在一定的联系的。因此,我们猜测,LncRNA对hBMSCs早期的成骨分化在某些层面上是具有调控作用的,也许发生并贯穿整个转录过程。所以,为了明确两者之间的关系,本次研究将通过体外增殖培养,利用特有的干细胞培养基,使其向成骨细胞方向诱导分化后,进行成骨分化的鉴定,为LncRNA筛选LncRNA进行功能验证做准备。研究方法：1.将购买的原代hBMSCs在体外扩增培养,将P5代hBMSCs在成骨诱导培养基内行成骨诱导分化7天后,观察细胞形态。2.对hBMSCs进行成骨诱导分化,将经过分化7天后的hBMSCs标记为实验组(D7),与骨诱导前的hBMSCs进行比对,同时记为对照组(D0),通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色的方法,鉴定成骨的效能。3.检测成骨分化相关因子(Osterix、ALP、OPN)的表达情况,通过实时荧光定量PCR鉴定成骨结果。研究结果：1.原hBMSCs经体外扩增培养至P5代后,细胞生长情况良好,均呈长梭行。在成骨诱导培养基成骨诱导分化后,细胞由条索状变成短多角形,细胞增殖加速后细胞集聚呈团状。随后增殖速率下降,可见少量棕色结节。2.ALP染色结果显示,诱导7d后hBMSCs细胞表面附着深蓝色染料；而未经过分化的细胞几乎不能够染色；D7组与D0组相比,D7组能够明显的被ALP染色情况。而ALP染色结果表明,hBMSCs经过7d成骨分化诱导后能够呈现出一定的成骨分化能力。通过茜素红染色,我们发现,hBMSCs经过诱导7d后,细胞表面已经有少量的钙结节沉积；相比未诱导的细胞,其中未见钙结节；D7组与D0组相比,D7组具有明显的茜素红染色阳性情况。3.第5代hBMSCs进行成骨分化诱导7d后提取总RNA,2-ΔΔCT法分析结果,数据表明hBMSCs诱导7d后成骨特异性转录因子ALP、Runx2及OCN的表达量都呈上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。这三者中上调最明显的是ALP,ALP为hBMSCs成骨前期发挥作用的重要基因也是检测成骨效能的重要标志,结果说明hBMSCs成骨分化诱导7d的时已经具备成骨分化的能力。第二章：hBMSCs成骨前后表达差异量大的LncRNA的筛选及鉴定研究目的：通过前期hBMSCs的成骨诱导分化7天后,通过LncRNA表达谱芯片检测筛选成骨诱导分化前后差异表达的LncRNA。同时选取以上4条LncRNA进一步探索LncRNA在hMSCs成骨分化过程中的作用。为进一步具体LncRNA在成骨分化过程中的作用,我们将构建LncRNA的慢病毒载体,为后期转染hMSCs后观察其成骨效能的变化做准备。研究方法：1.本实验将D0及D7组细胞样本用Trizol试剂抽提总RNA,总RNA质量检测合格后,进行体外扩增并荧光标记,标记过程采用晶芯生物芯片通用标记试剂盒(Capi talBio).将标记后的产物在45℃下与Agilent公司4 x 180 K人1ncRNAV3.0芯片(包含37581条人1ncRNA特异探针及34235条人mRNA探针)杂交过夜。反应结束后,使用博奥Slide Washer8芯片洗干仪进行清洗后,对经过清洗的芯片进行扫描,获得杂交图片。并使用配套软件Agilent Feature Extraction(v10.7)对图片进行分析,然后提取数据。然后使用Agilent CeneSpring软件对数据进行差异分析,注意差异的倍数不低于2倍。2.从差异表达倍数较大的LncRNA中,选取4条LncRNA进行验证,其中两条上调,另两条下调,通过荧光定量PCR鉴定结果的准确性。同时,选取这4条LncRNA做进一步功能实验。研究结果：1.第5代hBMSCs进行成骨分化诱导7d后进行LncRNA芯片筛选。结果发现,经过7d的成骨分化诱导,其中表达呈倍数增加超过2倍的LncRNA有923条,表达呈倍数减少超过2倍的有993条；倍增超过4倍的LncRNA有225条,倍减超过4倍的有120条；倍增超过8倍的LncRNA有60条,倍减超过8倍的有17条。挑选阳性克隆送life technologies公司进行测序,测序的结果与预期的结果一致。2. RT-PCR验证结果显示：与DO组相比,LncRNA ENST00000523786.1和LncRNA ENST00000436715.1(H19)在D7组中表达明显上调(P<0.05);LncRNA HIT000218960,LncRNA ENST00000502125.2在D7组中表达明显下调(P<0.05)。LncRNA芯片筛选的结果与实时荧光定量PCR结果一致。第三章LncRNAENST00000502125.2对hMSCs成骨分化的功能验证研究目的：本章节将根据ENSEMBL数据库提供信息获取LncRNA序列,通过提取hMSCs细胞总RNA,RT-PCR获得目的DNA片段,构建LncRNA’慢病毒载体,转染克隆细胞,得到慢病毒颗粒转染hMSCs,探讨LncRNA ENST00000502125.2在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的重要功能,观察其成骨效能的变化。预测其在人骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制,为组织工程骨的研究提供新的LncRNA位点,将揭示特定位点的LncRNA分子调控的hMSCs成骨分化机制。研究方法：1.根据ENSEMBL数据库提供信息LncRNA ENST00000436715.1(H19)长度为861bp, LncRNA HIT000218960的长度为229bp,LncRNA ENST00000502125.2的长度为1930bp。2.通过Trizol法提取hMSCs(P5代)细胞总RNA,RT-PCR获得目的DNA片段。3.设计合适引物,获得目的DNA片段测序确认正确后,后期构建慢病毒载体。4.选取其中能够有效扩增的LncRNA,根据前期芯片实验得到的LncRNA序列信息设计引物,构建LncRNA的过表达慢病毒载体及shRNA载体,测序确认插入目的片段正确后,大量提取质粒,转染293TN细胞,包装重组病毒,通过GFP观察慢病毒载体转染效率,80%以上细胞有绿色荧光为合格,共构建LncRNA阴性对照的慢病毒颗粒。5.功能获得性研究：①实验组：选取LncRNA ENST00000502125.2过表达慢病毒载体转染hMSCs后定量检测过表达慢病毒载体转染效率,之后在成骨诱导培养基中培养7天后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色并通过Real-time PCR检测LncRNA ENST00000502125.2表达情况。②对照组：空载体转染hMSCs后在成骨诱导培养基中培养7天后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色并通过Real-time PCR检测LncRNA ENST00000502125.2表达情况。6.功能缺失性研究：①实验组：LncRNA ENST00000502125.2-慢病毒干扰载体转染hMSCs后定量检测慢病毒干扰载体转染效率,之后在成骨诱导培养基中培养7天后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色并通过Real-time PCR检测LncRNA ENST00000502125.2表达情况。②对照组：空载体转染hMSCs后在成骨诱导培养基中培养7天后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色并通过Real-time PCR检测LncRNA ENST00000502125.2表达情况。研究结果：1. LncRNA ENST00000436715.1和LncRNA HIT000218960以TAKARA一步法RT试剂盒做RT-PCR,反应完毕后,取2ul电泳检测,片段大小与ENSEMBL数据库提供信息不一致,实验重复3次,结果一致。2.以Real-time PCR引物进行LncRNA检测,LncRNA ENST00000436715.1和LncRNA HIT000218960未能扩增出预期,产物与理论扩增产物不符,考虑LncRNA丰度低或者在hMSCs传代培养至5代后,上述两条LncRNA不表达。3.根据LncRNA ENST00000502125.2合成引物,以hMSCs为模板进行RT-PCR反应,LncRNA ENST00000502125.2可以得到有效扩增。4. LncRNA ENST00000502125.2在有效扩增后,回收RT-PCR产物,以NheI+NotI酶切LncRNA ENST00000502125.2产物,与同样处理的pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP的载体连接后,转化大肠杆菌DH5a,得到克隆后,以扩增的引物进行菌落PCR,得到9个LncRNA ENST00000502125.2的阳性克隆。5.挑选阳性克隆送life technologies公司进行测序反应,测序结果与预期的结果一致。6.将对照的载体与干扰载体同时包装病毒,然后转染293NT细胞。通过筛选并收集细胞,通过定量PCR方法检测各组细胞中LncRNA ENST00000502125.2的表达。沉默的LncRNA序列没有影响病毒包装,同时沉默序列的干扰病毒能够很好的转染293NT细胞,结果显示序列具有较好的干扰效果。7.慢病毒过表达载体转染效果的结果显示：转染过表达病毒的细胞内LncRNA ENST00000502125.2转录水平增加明显,从而成功通过慢病毒转染在hMSCs细胞中获得了LncRNA ENST00000502125.2的外源性表达。8.经ALP、茜素红染色可知,于hMSCs中转染进过表达的LncRNA ENST00000502125.2且经过成骨分化诱导后,hMSCs的成骨分化能力明显比对照组弱,从而说明了LncRNAENST00000502125.2在hMSC中对于成骨分化能力起着负相关关系,即抑制成骨分化功能。全文结论：1.hMSCs在适宜的体外环境下,经诱导可以成骨分化为成骨细胞。2.以LncRNA高通量的芯片检测技术,筛选出hMSCs成骨诱导分化7天后与成骨分化前表达差异呈倍数关系的LncRNA,通过定量PCR验证部分表达差异显著的LncRNA,两者的结果一致。3. LncRNA ENST00000502125.2在hBMSCs成骨分化诱导后表达量下降,说明其在hBMSCs是成骨分化过程中起着负性作用。4.LncRNA ENST00000502125.2慢病毒干扰载体转染hBMSCs后,结果显示,hBMSCs成骨分化能力增强,而慢病毒过表达载体转染的结果相反。说明LncRNA ENST00000502125.2具有抑制hBMSCs成骨分化的能力。