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研究背景:脓毒症（sepsis）在2016年重新定义为“由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍”。伴随着人口老龄化,其高发病率和死亡率以及巨大的经济负担,严重威胁着人类健康状况。脓毒症患者存在两种免疫状态,即从过度免疫激活发展为广泛免疫抑制。以往,人们普遍认为脓毒症的主要危害是由于宿主感染微生物产生过度炎症所致,然而,单纯的抗炎疗法并没有获得实质性成功。近年来,人们逐渐认识到脓毒症免疫抑制导致的二次感染才是其高死亡率的重要原因。内毒素耐受是指细胞或生物体第一次接触低剂量LPS（Lipopolysaccharide,脂多糖）刺激后,再次接触高剂量LPS刺激时的低反应性,主要表现为LPS刺激组织细胞,炎症细胞因子表达降低。脓毒症患者体循环白细胞可表现出这种LPS低反应性,即产生内毒素耐受,虽然短期耐受可以避免过度炎症,有利于宿主,但长期内毒素耐受是导致脓毒症免疫抑制及二次感染的重要原因。因此,逆转内毒素耐受,恢复免疫稳态,保持宿主对继发性感染的免疫力对于脓毒症患者的治疗及预后具有重要的作用。BCG（Bacillus Calmette-Guérin,卡介苗）是一种减毒活疫苗,近年来,有大量关于BCG诱导训练免疫,增加机体非特异性保护,增强免疫应答的报道。基于以上研究,我们推测BCG作为一种免疫刺激剂,可能会逆转内毒素耐受,恢复脓毒症患者病理性免疫抑制状态。目的:通过构建细胞内毒素耐受模型,评估内毒素耐受巨噬细胞RAW 264.7相关基因表达变化,检测BCG菌体裂解液对内毒素耐受的影响并初步探讨其作用机制,以期为脓毒症患者的治疗提供有价值的参考。方法:1.采用小鼠巨噬细胞RAW 264.7,分为以下7组,即M+M对照组:先用完全DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium,杜尔贝科改良伊格尔培养基）培养20h,再用完全DMEM培养3h;M+L内毒素刺激组:先用完全DMEM培养20h,再用100ng/ml LPS刺激细胞3h;L+M对照组:先用10ng/ml LPS培养细胞20h,再用完全DMEM培养3h;L+L内毒素耐受组:先用10ng/ml LPS培养细胞20h,再用100ng/ml LPS刺激细胞3h;L+5B+M对照组:先用10ng/ml LPS培养细胞20h,随后提前15min加入蛋白终浓度为5μg/ml BCG菌体裂解液,再用完全DMEM培养3h;L+5B+L和L+20B+L BCG处理组:先用10ng/ml LPS培养细胞20h,在第二次LPS刺激前15min,分别加入蛋白终浓度为5μg/ml及20μg/ml BCG菌体裂解液,随后用100ng/ml LPS刺激细胞3h。各组在第一次20h培养后,细胞均用DMEM洗3遍,再进行随后处理。2.提取各组细胞RNA,通过实时荧光定量PCR检测炎症细胞因子TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α,肿瘤坏死因子-α）和IL-1β（Interleukin-1β,白介素-1β）、脂滴相关蛋白ADRP（Adipose Differentiation Related Protein,脂肪分化相关蛋白）、抗菌肽CAMP（Cathelicidin Antimicrobial Peptide,Cathelicidin抗菌肽）、I型干扰素IFN-β（Interferon-β,β-干扰素）以及抗病毒蛋白Viperin（Virus Inhibitory Protein,病毒抑制蛋白）的m RNA表达水平变化。3.提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质印迹检测Viperin和蛋白质磷酸酶CN（calcineurin,钙调神经磷酸酶）蛋白表达水平变化。4.通过油红O染色检测细胞LD（Lipid Droplet,脂滴）含量变化。结果:1.与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）炎症细胞因子TNF-α（18.32±1.06 vs.1.00,p＜0.01）和IL-1β（10945.00±2037.00 vs.1.00,p＜0.01）m RNA表达显著增高;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）TNF-α（2.68±0.27 vs.18.32±1.06,p＜0.01）和IL-1β（2081.00±462.80 vs.10945.00±2037.00,p＜0.05）m RNA表达显著降低;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）TNF-α（3.59±0.26 vs.2.68±0.27,p＜0.05）和IL-1β（4506.00±924.30 vs.2081.00±462.80,p＜0.05）m RNA表达比耐受组显著提高;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）TNF-α（6.70±1.23 vs.2.68±0.27,p＜0.05）和IL-1β（6089.00±555.80 vs.2081.00±462.80,p＜0.01）m RNA表达比耐受组进一步显著提高。2.与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）LD含量（1.26±0.06 vs.1.00,p＜0.05）及ADRP（1.66±0.22 vs.1.00,p＜0.05）m RNA表达显著增加;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）LD含量（3.85±0.48 vs.1.26±0.06,p＜0.05）及ADRP（5.67±0.78 vs.1.66±0.22,p＜0.01）m RNA表达进一步显著增加;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）LD含量（4.21±0.71 vs.3.85±0.48,p＞0.05）及ADRP（5.28±1.07 vs.5.67±0.78,p＞0.05）m RNA表达与耐受组无统计学差异;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）LD含量（3.41±0.35 vs.3.85±0.48,p＞0.05）及ADRP（4.97±0.73 vs.5.67±0.78,p＞0.05）m RNA表达也与耐受组无统计学差异。3.与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）CAMP（51.18±5.94 vs.1.00,p＜0.01）m RNA表达显著增高;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）CAMP（27.00±4.60 vs.51.18±5.94,p＜0.01）m RNA表达显著降低;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）CAMP（52.68±9.61 vs.27.00±4.60,p＜0.05）m RNA表达比耐受组显著提高;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）CAMP（71.90±10.99 vs.27.00±4.60,p＜0.01）m RNA表达比耐受组进一步显著提高。4.与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）IFN-β（956.60±40.60 vs.1.00,p＜0.01）和Viperin（351.60±52.31 vs.1.00,p＜0.01）m RNA表达显著增高;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）IFN-β（22.64±2.94 vs.956.60±40.60,p＜0.01）和Viperin（98.75±4.11 vs.351.60±52.31,p＜0.01）m RNA表达显著降低;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）IFN-β（26.80±4.91 vs.22.64±2.94,p＞0.05）m RNA表达与耐受组无统计学差异,Viperin（143.50±15.06 vs.98.75±4.11,p＜0.05）m RNA表达比耐受组显著提高;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）IFN-β（57.86±10.63vs.22.64±2.94,p＜0.05）和Viperin（210.10±13.30 vs.98.75±4.11,p＜0.01）m RNA表达比耐受组显著提高。此外,与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）Viperin（2.26±0.23 vs.0.00,p＜0.01）蛋白表达显著增高;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）Viperin（1.40±0.10 vs.2.26±0.23,p＜0.05）蛋白表达显著降低;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）Viperin（2.00±0.17 vs.1.40±0.10,p＜0.05）蛋白表达比耐受组显著提高;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）Viperin（1.89±0.04 vs.1.40±0.10,p＜0.01）蛋白表达也比耐受组显著提高。5.与对照组（M+M）相比,刺激组（M+L）CN（0.99±0.05 vs.1.00,p＞0.05）蛋白表达水平无统计学差异;与刺激组（M+L）相比,内毒素耐受组（L+L）CN（0.57±0.07vs.0.99±0.05,p＜0.01）蛋白表达水平显著降低;5μg/ml BCG处理组（L+5B+L）CN（0.62±0.06 vs.0.57±0.07,p＞0.05）蛋白表达水平与耐受组无统计学差异;20μg/ml BCG处理组（L+20B+L）CN（0.62±0.06 vs.0.57±0.07,p＞0.05）蛋白表达水平也与耐受组无统计学差异。结论:1.LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7,TNF-α、IL-1β、ADRP、CAMP、IFN-β以及Viperin m RNA表达水平增加;LD含量增加。2.RAW 264.7细胞内毒素耐受后,LPS再刺激,TNF-α、IL-1β、CAMP、IFN-β以及Viperin m RNA表达水平降低;LD含量及ADRP m RNA表达水平增加。3.BCG菌体裂解液可以逆转RAW 264.7细胞内毒素耐受,提高耐受细胞TNF-α、IL-1β、CAMP、IFN-β以及Viperin m RNA表达水平,但不影响LD含量及ADRP m RNA表达水平。4.内毒素耐受RAW 264.7细胞Viperin蛋白表达水平降低,BCG菌体裂解液可以逆转内毒素耐受,提高耐受细胞Viperin蛋白表达水平。5.内毒素耐受RAW 264.7细胞CN蛋白表达水平降低,BCG菌体裂解液逆转内毒素耐受而没有提高CN蛋白表达水平。