环孢素A(cyclosporine A, CsA)是一个具有划时代意义的免疫抑制剂,其临床应用显著改善了实体器官移植患者的近期存活率。尽管新型免疫抑制剂不断涌现,CsA仍然是器官移植后免疫抑制和抗排斥反应的首选药物。前期研究表明,CsA对肝肾急性毒性主要是炎性细胞浸润,是可逆的；慢性毒性所致肝肾间质纤维化是不可逆的。肝肾毒性已成为限制其临床应用的主要副作用,成为器官移植领域亟待解决的问题。罗格列酮(rosiglitazone, RGZ)属于噻唑烷二酮类(thiazolidinediones, TZDs)胰岛素增敏剂,通过激活过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPARγ)发挥作用。PPARγ属于Ⅱ型核受体超家族成员,参与脂肪代谢、核代谢、细胞周期和细胞分化等细胞代谢过程,并且参与炎症和细胞外基质重塑,从而在抗炎、抑制纤维化等非代谢性调节方面均发挥起重要作用。基于以上背景,本研究推测PPARγ可能成为防治CsA所致器质性病变的一个新靶点,目前国内外尚未见报道。本实验首先构建低盐饮食(low salt diet, LSD)饲养的大鼠肝肾毒性模型,罗格列酮干预并观察其对CsA肝肾毒性的保护作用,然后在体外利用大鼠肾间质成纤维(normal rat kidney, NRK)细胞和肝星形状细胞(hepatic stellate cells, HSCs),进一步探讨其可能的内在机制。本实验分为以下两个部分：第一部分罗格列酮防治环孢素A所致大鼠肾毒性的分子机制研究一体内实验方法1.实验分组：健康雄性SD大鼠(体重220～250g),低盐饮食(钠质量分数0.038%)饲养1周后随机分成4组：(1)对照组(n=12):LSD+橄榄油(1 .5ml·kg-1·d-1)皮下注射+NS (5ml·kg-1·d-1)灌胃；(2)RGZ组(n=12)：LSD+橄榄油(1.5ml·kg·d-1)皮下注射+RGZ(5mg·kg-1·d-1)灌胃；(3)CsA组(n=15):LSD +CsA (15mg·kg-1·d-1)皮下注射+NS(5ml·kg-1·d-1)灌胃；(4)RGZ+CsA组(n=15):LSD+CsA(15mg·kg-1·d-1)皮下注射+RGZ(5mg·kg-1·d-1)灌胃。于实验第14天每组随机收获6只大鼠,实验第35天收获全部大鼠。2.体重和生化指标(Ccr, ALB)检测：收获大鼠前记录体重。血清肌酐(serum creatinine, sCr)、尿肌酐(urine creatinine, uCr)和血清ALB (albumin, ALB)用日立7600型全自动生化分析仪完成。3.肾组织病理改变以HE染色观察单个核细胞浸润数,以Masson染色观察肾间质纤维化比例。4.免疫组织化学染色(Immunohistochemistry, IHC)检测大鼠肾组织CD68和COLIV的表达。5.实时荧光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction)检测肾组织中骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子(Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted, RANTES) mRNA表达。6.蛋白印迹分析(Western blotting)检测OPN、RANTES和纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)蛋白的表达。7.反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)和组织型基质金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP-1) mRNA表达。结果1.体重：与对照组相比,CsA组大鼠体重显著下降(P<0.05),给予罗格列酮后大鼠体重下降减慢,其第35天体重与CsA组有显著性差异(P<0.05)。2.生化指标(Ccr、ALB):实验第14天,CsA组Ccr和血清ALB显著下降(P<0.05),而RGZ+CsA组的Ccr和血清ALB下降程度低于CsA组,但两组并无显著性差异(P>0.05)；实验第35天,CsA组Ccr和血清ALB下降更显著(P<0.05), RGZ+CsA组较CsA组Ccr显著升高(P<0.05),两组间血清ALB并无显著性差异(P>0.05)。3.单个核细胞浸润：实验第14天时,与对照组比较,CsA组肾小管间质单个核细胞浸润数显著增加(P<0.05)；与CsA组比较,RGZ+CsA组肾小管间质浸润的单个核细胞数显著减少(P<0.05)。4.间质纤维化：实验第35天时,Masson染色结果显示,与对照组相比,CsA组肾间质纤维化程度显著增加(P<0.05)；与CsA组相比,RGZ+CsA组肾间质纤维化程度显著减少(P<0.05)。5. CD68IHC染色：实验第14天,与对照组相比,CsA组CD68 IHC染色显著升高(P<0.05), RGZ+CsA组CD68表达上升幅度显著低于CsA组(P<0.05),RGZ组与对照组相比无明显变化；实验第35天,CsA组CD68表达较第14天减少,但仍显著高于对照组(P<0.05),与同时期CsA组比较,RGZ+CsA组CD68表达显著减低(P<0.05), RGZ组与对照组相比无显著性差异。6. COLIVIHC染色：实验第14天,CsA组COLIV表达与对照组相比显著增加,差异显著(P<0.05),与RGZ+CsA组相比无显著性差异(P>0.05), RGZ组与对照组无差异(P>0.05)；实验第35天,与对照组相比CsA组COLIV表达显著升高(P<0.05),罗格列酮显著改善环孢素A引起的COLIV表达的升高(P<0.05), RGZ组与对照组相比无显著性差异。7.OPN：对照组OPN mRNA和蛋白有少量基础表达,RGZ组同对照组,无显著性差异(P>0.05); CsA组及CsA+RGZ组OPN mRNA和蛋白表达增加(P<0.05); CsA+RGZ组OPN mRNA和蛋白表达显著低于CsA组(P<0.05)。8. RANTES:对照组RANTES mRNA和蛋白有少量基础表达,RGZ组同对照组,无显著性差异(P>0.05); CsA组及CsA+RGZ组OPN mRNA和蛋白表达增加(P<0.05); CsA+RGZ组RANTES mRNA和蛋白表达显著低于CsA组(P<0.05)。9.MMP-9：对照组MMP-9 mRNA有少量基础表达,RGZ组同对照组,无显著性差异(P>0.05);CsA组及RGZ+CsA组MMP-9 mRNA表达增加(P<0.05),且第14天高于第35天；RGZ+CsA组第14天及第35天MMP-9 mRNA表达均显著低于同时限CsA组(P<0.05)。10.TIMP-1:对照组TIMP-1 mRNA有少量基础表达,RGZ组同对照组,无显著性差异(P>0.05);CsA组及RGZ+CsA组TIMP-1 mRNA表达增加(P<0.05),且第35天高于第14天；RGZ+CsA组第14天及第35天TIMP-1 mRNA表达均显著低于同时限CsA组(P<0.05)。11.FN：第35天时,对照组FN蛋白有少量基础表达,RGZ组同对照组；CsA组及CsA+RGZ组FN蛋白表达增加(P<0.05);CsA+RGZ组FN蛋白表达显著低于CsA组(P<0.05)。二体外实验方法1. PPARγ基因的siRNA载体构建、筛选和扩增。2.将前述研究筛选的PPARγ基因的siRNA载体pRNAT- U6.2-PPARγ转染至体外培养的NRK细胞。3.常规方法体外培养NRK细胞。实验分组：(?)对照组(N)：单一NRK细胞,不加处理；(?)RGZ组(R):NRK细胞,加RGZ(终浓度10μmol/L);(?)CsA组(M):NRK细胞,加CsA(终浓度为1.0μg/ml); CsA+RGZ组(Z):NRK细胞,同时加CsA(终浓度为1.0μg/ml)及RGZ(终浓度10μmol/L) CsA+RGZ+siRNA组(S)：质粒236-PP-1转染NRK细胞,同时加入CsA(终浓度为1.0μg/ml)及RGZ(终浓度10μmol/L);(注：时间及浓度的选择参见刘章锁教授博士毕业论文)4.四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖。5.实时荧光定量PCR检测PPARγmRNA表达。6. RT-PCR检测MMP-9和TIMP-1 mRNA表达。7. Western blotting检测FN蛋白的表达。结果1.成功构建3个靶向大鼠PPARγ基因的真核siRNA载体,经脂质体介导重组质粒转染细胞筛选出236-PP-1质粒转染率高。2.细胞增殖：CsA明显抑制NRK细胞增殖(P<0.05); RGZ与CsA合用后,对细胞增殖的抑制作用更明显(P<0.05)；应用PPARγ基因的siRNA后,罗格列酮对CsA刺激下细胞增殖的抑制作用减弱(P<0.05)。3. PPARγ:CsA明显上调PPARγmRNA表达(P<0.05); RGZ与CsA合用后,PPARγmRNA表达下降(P<0.05)；应用含PPARγ基因的siRNA后,与RGZ+CsA组相比,PPARγmRNA表达显著下降(P<0.05)。4. MMP-9:CsA明显上调MMP-9 mRNA表达(P<0.05); RGZ与CsA合用后,MMP-9 mRNA表达下降(P<0.05)；应用含PPARγ基因的siRNA后,MMP-9mRNA表达有所增加(P<0.05)。5. TIMP-1:CsA明显上调TIMP-1 mRNA表达(P<0.05);RGZ与CsA合用后,TIMP-1 mRNA表达下降(P<0.05)；应用含PPARγ基因的siRNA后,TIMP-1 mRNA表达有所增加(P<0.05)。6. FN:CsA明显上调FN蛋白表达(P<0.05); RGZ与CsA合用后,FN蛋白表达下降(P<0.05)；应用含PPARγ基因的siRNA后,FN蛋白表达有所增加(P<0.05)。结论1.罗格列酮显著减轻CsA肾毒性大鼠早期肾脏小管间质单个核细胞浸润和晚期肾间质纤维化病变,延缓肾功能恶化；2.罗格列酮显著降低CsA肾毒性大鼠肾组织早期CD68的表达和OPN、RANTES mRNA及蛋白表达；3.罗格列酮显著下调CsA肾毒性大鼠肾组织晚期COLⅣ和FN蛋白的表达,减少细胞外基质(ECM)积聚,抑制间质纤维化；4.罗格列酮显著下调CsA肾毒性大鼠肾组织MMP-9和TIMP-1 mRNA表达,减少细胞外基质积聚,促进ECM降解,抑制纤维化的发生；5.罗格列酮显著减轻CsA诱导NRK细胞分泌的FN蛋白及MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达,减少细胞外基质聚集；6.成功构建了3个靶向大鼠PPARγ基因的真核siRNA表达载体,通过脂质体介导重组质粒转染,获得对NRK细胞具有高转染效率的siRNA表达载体；7.构建的siRNA质粒转染NRK细胞,能够有效地阻断NRK中PPARγmRNA的表达；8.采用RNAi技术阻断NRK细胞内PPARγ基因的表达,将降低罗格列酮部分逆转CsA所致肾间质纤维化的作用。第二部分罗格列酮防治环孢素A所致大鼠肝毒性的分子机制研究一体内实验方法1.实验分组：同肾脏部分。2.体重和生化指标(ALT, ALB)检测：收获大鼠前记录体重。血清谷丙转氨酶(ALT)和血清白蛋白(ALB)用日立7600型全自动生化分析仪完成。3.肝组织病理改变以HE染色观察单个核细胞浸润数,以Masson染色观察肝纤维化比例。4. Real-timePCR检测OPN和RANTES mRNA表达。5. Western blotting检测OPN、RANTES和FN蛋白的表达。6. RT-PCR检测TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA表达。7.比色法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱苷肽(glutathione, GSH)含量。结果1.体重：与对照组相比,CsA组大鼠体重显著下降(P<0.05),给予罗格列酮后大鼠体重下降减慢,其第35天体重与CsA组有显著性差异(P<0.05)。2.生化指标(ALT、ALB):CsA组的血清ALB水平显著下降(P<0.05),RGZ+CsA组下降程度小于CsA组,但两组间并无显著性差异(P>0.05)；CsA组ALT水平显著高于对照组(P<0.05),给予罗格列酮治疗后ALT升高程度显著降低(P<0.05)。3.单个核细胞浸润：与对照组比较,CsA组单个核细胞浸润数显著增加(P<0.05),CsA+RGZ组与CsA组比较单个核细胞浸润程度显著下降(P<0.05)。4.肝脏纤维化：与对照组比较,CsA组肝脏纤维化程度(Masson染色)显著增加(P<0.05),与之相比,CsA+RGZ组肝纤维化程度显著减轻(P<0.05)。实验第35天时,对照组FN蛋白有少量基础表达,与之相比CsA组及RGZ+CsA组FN蛋白表达增加(P<0.05)；与CsA组比较,RGZ+CsA组FN蛋白表达显著降低(P<0.05);RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。5.OPN：对照组OPN mRNA和蛋白有少量基础表达；CsA组及CsA+RGZ组OPN mRNA和蛋白表达增加(P<0.05);CsA+RGZ组OPN mRNA和蛋白表达显著低于CsA组(P<0.05);RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。6.RANTES:对照组RANTES mRNA和蛋白有少量基础表达；CsA组及CsA +RGZ组OPN mRNA和蛋白表达增加(P<0.05);CsA+RGZ组RANTES mRNA和蛋白表达显著低于CsA组(P<0.05):RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。7. TGF-β1:对照组TGF-β1 mRNA有少量基础表达；与对照组相比,CsA组及RGZ+CsA组TGF-β1 mRNA表达均显著增加(P<0.05),且第35天显著高于第14天(P<0.05);RGZ+CsA组第14天及第35天TGF-β1 mRNA表达均显著低于同时限CsA组(P<0.05);RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。8.MMP-9：对照组MMP-9 mRNA有少量基础表达；CsA组及RGZ+CsA组大MMP-9 mRNA表达增加(P<0.05),且第14天高于第35天(P<0.05)；RGZ+CsA组第14天及第35天MMP-9 mRNA表达均显著低于同时限CsA组(P<0.05);RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。9.TIMP-1:对照组TIMP-1 mRNA有少量基础表达；CsA组及RGZ+CsA组TIMP-1 mRNA表达增加(P<0.05),且第35天高于第14天(P<0.05)；RGZ+CsA组第14天及第35天TIMP-1 mRNA表达均显著低于同时限CsA组(P<0.05); RGZ组与对照组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。10.MDA和GSH含量：CsA可使实验第14天及第35天大鼠肝组织MDA活性增高、GSH活性降低(P<0.05)。罗格列酮可改善实验第14天时CsA导致的这一变化(P<0.05)。二体外实验方法1.常规方法体外培养大鼠肝星状细胞(HSC)。实验分组：同NRK细胞。2.MTT比色法检测细胞增殖。3. Real-time PCR检测PPAR Y mRNA表达。4. RT-PCR检测TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA表达。5. Western blotting检测FN蛋白的表达。6. ELISA法检测HSC-T6细胞分泌TGF-β1水平。7.比色法检测MDA和GSH含量。结果1.细胞增殖：CsA明显抑制HSC细胞增殖(P<0.05); CsA+RGZ组与CsA组相比,对细胞增殖的抑制作用更明显(P<0.05)；应用PPARγ基因的siRNA后,罗格列酮对CsA刺激下细胞增殖的抑制作用减弱(P<0.05)。2. PPARγ:CsA明显上调PPARγmRNA表达(P<0.05)；罗格列酮与CsA合用后,PPARγmRNA表达下降(P<0.05)；应用含PPARγ基因的siRNA后,与RGZ+CsA组相比,PPARy mRNA表达显著下降(P<0.05)。3. TGF-β1:与对照组相比,CsA组TGF-β1mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),与之相比,罗格列酮显著改善CsA引起的高表达(P<0.05)。应用PPARγ基因的siRNA后,TGF-β1mRNA和蛋白表达有所增加(P<0.05)。4. MMP-9:CsA明显上调MMP-9 mRNA表达(P<0.05)；罗格列酮与CsA合用后,MMP-9 mRNA表达下降(P<0.05)；应用PPARγ基因的siRNA后,MMP-9mRNA表达有所增加(P<0.05)。5. TIMP-1:CsA明显上调TIMP-1 mRNA表达(P<0.05)；罗格列酮与CsA合用后,TIMP-1 mRNA表达下降(P<0.05)；应用PPARγ基因的siRNA后,TIMP-1 mRNA表达有所增加(P<0.05)。6. FN:CsA明显上调FN蛋白表达(P<0.05)；罗格列酮与CsA合用后,FN蛋白表达下降(P<0.05)；应用PPARγ基因的siRNA后,FN蛋白表达有所增加(P<0.05)。7.MDA和GSH:CsA可使HSC的GSH表达显著降低,同时刺激MDA大量产生(P<0.05)；罗格列酮显著改善CsA引起的这种改变(P<0.05)；应用PPARY基因的siRNA后,罗格列酮的这种改善作用显著降低(P<0.05)。结论1.罗格列酮显著减轻CsA肝毒性大鼠早期肝脏汇管区单个核细胞浸润和晚期肝脏纤维化,保护肝功能；2.罗格列酮显著降低CsA肝毒性大鼠肝组织早期OPN、RANTES mRNA及蛋白表达;3.罗格列酮显著下调CsA肝毒性大鼠肝组织晚期TGF-β1 mRNA及FN蛋白的表达,减少细胞外基质积聚,抑制肝纤维化；4.罗格列酮显著下调CsA肝毒性大鼠肝组织MMP-9和TIMP-1 mRNA表达,减少细胞外基质积聚,促进ECM降解,抑制纤维化的发生；5.罗格列酮显著减轻CsA诱导HSC-T6细胞分泌的层粘连蛋白及MMP-9、TIMP-1 mRNA表达,减少细胞外基质积聚；6.构建的siRNA质粒转染HSC-T6细胞,能够有效地阻断HSC-T6中PPARγmRNA的表达；7.采用RNAi技术阻断HSC-T6细胞内PPARγ基因的表达,导致TGF-β1mRNA表达上调和分泌增加,将降低罗格列酮部分逆转CsA所致肝纤维化的作用。