大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内它的发病率和致死率都比较高，并且有年轻化和上升趋势。大肠癌发病机理尚不清楚，早期诊断仍有困难，由于症状不明显，确诊时往往已到肿瘤的中、晚期。目前一线治疗手段主要是手术和化疗。传统的治疗手段由于缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时也可能损害机体的正常组织细胞，不能达到良好的抗肿瘤效果，手术后5年生存率不到40％。因此寻找一种新型非手术干预的靶向性治疗方法对于大肠癌的预防和治疗具有非常重要意义。 腐胺、精脒和精胺统称为多胺，是一类参与细胞内多种功能反应的多聚阳离子脂肪族化合物，这些阳离子电荷使得多胺可通过静电作用与细胞内的含有多聚阴离子的大分子化合物如DNA、RNA、蛋白质等发生反应而调控细胞增殖。多胺及多胺代谢相关的酶参与细胞生长、分化和死亡的调节，是细胞增殖的调节分子。多胺对于正常细胞的生长是必须的，同时多胺的异常代谢在肿瘤的发展过程中又发挥重要作用。在迅速增殖的正常细胞以及肿瘤细胞中，多胺的含量明显升高。人们早已认识到多胺含量增高与结直肠癌的发生发展密切相关，与肿瘤的预后和复发有明显的相关性，甚至被看作是大肠癌检测的肿瘤标志物。以多胺代谢通路为靶点，降低细胞内多胺水平，在肿瘤治疗研究中具有非常重要的意义。 多胺合成途径有两个关键酶，即鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdeMetDC)。它们一直是研究的重点。我们之前的研究表明，与相应的正常组织相比，在结肠癌组织中ODC和AdeMetDC的表达明显升高，而且通过抑制它们的表达可以下调多胺的合成，从而抑制肿瘤生长。精脒/精胺N1乙酰基转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT)，是多胺分解途径中的第一个限速酶.它是一个丙氨基乙酰转移酶，主要调控多胺的乙酰化过程，乙酰CoA在SSAT作用下，分别将精脒/精胺转化成N1-乙酰精脒和N1-乙酰精胺中间体，随后在多胺氧化酶(PAO)作用下生成腐胺。 与ODC不同，SSAT可被生长抑制剂及各种有毒刺激诱导产生。Slavoljub Vujcic等研究者发现在SSAT水平上促进多胺降解能更有效的降低细胞内多胺水平，这一点在乳腺癌细胞MCF-7中得到证实。SSAT的活性增加，催化精胺逆转化为精脒及精脒逆转化为腐胺，最终使多胺池耗竭，诱导细胞凋亡。 针对肿瘤的靶向问题，本课题应用了肿瘤特异性启动子---人类端粒酶启动子(hTERT)。端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，能介导端粒重复序列的合成并维持其稳定，具有逆转录酶的活性。hTERT在正常细胞和肿瘤细胞中均表达，但除了干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞外，hTERT的表达几乎只限制在肿瘤细胞中。 hTERT在超过85％的人类恶性肿瘤中调控端粒酶的选择性表达，而在大多数正常组织中不起作用。因此，我们选择大肠癌为目标，以SSAT为靶点，利用hTERT启动子只在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达的特点，构建了一种由hTERT启动子介导的、表达SSAT的重组腺病毒载体。系统研究了其对大肠癌细胞生长的抑制作用，并初步观察了其靶向性抑制肿瘤细胞增殖的作用，为进一步研究肿瘤靶向性基因治疗的方法提供了理论依据和技术对策。 因该研究需要SSAT抗体，但该抗体当时尚难以获得，所以为完成该项研究，该文首先构建了SSAT原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达SSAT融合蛋白，纯化后免疫小鼠，制备了鼠抗人SSAT多克隆抗体。ELISA和Western blotting验证该抗体可与SSAT特异性结合。这为该文的完成提供了实验材料，为后续研究奠定了基础。 第一部分:人SSAT基因原核表达载体的构建、表达、纯化及其多克隆抗体的制备实验 目的：构建SSAT基因的原核表达载体，并表达纯化以获得重组人SSAT融合蛋白，制备抗人SSAT抗体，为后续研究奠定基础。 实验方法： 1.RT-PCR扩增SSAT全长，通过TA克隆技术将其插入原核表达载体pTriEx-4中，构建重组的表达质粒pTriEx-SSAT。 2.将构建的重组表达质粒pTriEx-SSAT转化入大肠杆菌E.coli JM109(DE3)，诱导表达SSAT蛋白，SDS-PAGE鉴定表达产物。 3.运用亲和层析的原理，应用HisTrapTM蛋白纯化试剂盒纯化出SSAT蛋白，SDS-PAGE及Western blotting鉴定纯化产物。 4.将纯化的SSAT融合蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原，免疫小鼠，取血清制备抗SSAT多抗；ELISA及Western blotting测定血清抗体的效价及特异性。 实验结论：成功构建出含有SSAT基因编码序列的原核表达载体pTriEx-SSAT；在E.coli JM109(DE3)中表达重组蛋白，经HisTrapTM蛋白纯化柱纯化得到纯化的重组SSAT蛋白；并以其为免疫原制备了抗人SSAT多克隆抗体，为后续的研究工作奠定基础。 第二部分:hTERT启动子介导的人SSAT表达的腺病毒载体的构建实验 目的：构建hTERT启动子介导的人SSAT表达的腺病毒载体，为降低多胺水平提供新工具和手段。 实验方法：应用RT-PCR方法扩增出SSAT mRNA 翻译区的基因片断。插入pMD-18T载体中，经Nco Ⅰ、XbaⅠ酶切回收，插入质粒pGL3-hTERT中，然后将重组的pGL3-hTERT-SSAT用Sa1 Ⅰ和HindⅢ双酶切回收，插入穿梭质粒pAdTrack形成重组质粒pAdTrack-hTERT-SSAT。经PmeⅠ酶切线性化后，转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-hTERT-SSAT，经PacⅠ酶切后，转染293细胞包装和扩增出腺病毒颗粒。 实验结论：成功构建并扩增出SSAT腺病毒载体，为大肠癌的基因治疗和预防研究提供了必要的工具。 第三部分:腺病毒介导的SSAT表达抑制大肠癌及其肿瘤靶向性的体外研究实验 目的：研究重组腺病毒Ad-hTERT-SSAT对大肠癌细胞多胺合成，细胞增殖以及侵袭的抑制作用，并初步观察其靶向性抑制肿瘤细胞增殖的作用。 实验方法： 1.通过MTS法测定不同MOI的腺病毒对大肠癌HT-29和LoVo细胞的基因转染效率，以找到不同细胞的最适感染滴度。 2.采用Western印迹技术检测重组腺病毒感染大肠癌细胞后SSAT蛋白表达情况，并利用高效液相(HPLC)法检测重组腺病毒对大肠癌细胞中多胺含量的影响。 3.采用MTS和克隆形成实验检测重组腺病毒Ad-hTERT-SSAT对大肠癌细胞HT-29和LoVo细胞增殖的抑制作用。 4.采用流式细胞术检测Ad-hTERT-SSAT对HT-29和LoVo细胞周期分布的影响。 5.采用Matrigel侵袭实验分析重组腺病毒对大肠癌细胞侵袭活性的影响。 6.Ad-hTERT-SSAT分别感染胃癌细胞MGC803、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549等多种肿瘤细胞和人胚肺成纤维细胞HELF和人正常肝细胞QSG-7701等正常细胞，以不同的MOI值病毒感染24小时以后观察细胞状态和荧光强度。并通过MTS法观察最适MOI值感染后对细胞生长增殖的影响。 实验结论：①Ad-hTERT-SSAT可有效增强大肠癌细胞中SSAT基因表达，使细胞周期阻滞于S期，使细胞增殖受到抑制，提示其有治疗大肠癌的作用。②hTERT启动子介导的SSAT基因表达可能具有靶向性抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用。 第四部分:腺病毒介导的SSAT表达引起大肠癌细胞周期阻滞于S期的分子机理研究实验目的：观察Ad-hTERT-SSAT对S期主要的细胞周期调节蛋白的调控作用，研究Ad-hTERT-SSAT引起大肠癌细胞周期阻滞于S期的分子机制。 实验方法： 1.Western blotting检测Ad-hTERT-SSAT对细胞周期调节蛋白Cyclin A和Cdk蛋白水平的影响作用。 2.半定量RT-PCR法检测Ad-hTERT-SSAT对细胞内cyclin A和Cdk2的mRNA水平的影响作用。 3.通过克隆技术构建Cyclin A启动子的荧光素酶报告质粒(pGL3-cyclin A)，检测Ad-hTERT-SSAT对Cyclin A启动子活性的影响。 4.采用Western blotting和RT-PCR法检测Ad-hTERT-SSAT对核转录因子E2F-1表达的影响。 实验结论：Ad-hTERT-SSAT抑制S期主要的细胞周期蛋白Cyclin A的转录和翻译，并下调Cyclin A启动子的活性，同时抑制其上游核转录因子E2F-1的表达，从而证明Ad-hTERT-SSAT可能是通过下调Cyclin A启动子活性，抑制其基因表达，引起细胞周期阻滞，而起到抑制细胞增殖的作用。