第一部分 DJB和SG手术对Fetuin A的影响以及其在减重手术缓解2型糖尿病中的作用研究背景2型糖尿病（Type2 diabetesmellitus,T2DM）是一种重要的慢性疾病,在世界范围内广泛流行,且发病率逐年上升,已经成为亟待解决的全球公共健康问题,但传统的糖尿病治疗对患者血糖的控制效果并不理想。减重手术（B ariatric surgery）的出现和临床应用为广大患者和医生提供了新的选择。大量的临床和基础研究证实,减重手术在控制2型糖尿病方面具有迅速、持久的效果,尤其是合并肥胖的糖尿病的患者。袖状胃切除术（Sleevegastrectomy,SG）、Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastric bypass,RYGB）是全球开展最广泛的两种减重手术,而十二指肠空肠旁路术（Duodenal-jejunalbypass,DJB）最初是一种实验性手术,用来研究RYGB肠道重构在改善糖尿病中的作用,具有与RYGB类似的改善糖尿病的作用,但却并不会引起体重的降低。虽然减重手术具有明确的改善T2DM的临床疗效,但相关机制尚不明确。肝脏可以产生特殊的细胞因子,通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式影响自身或者其他组织器官的代谢过程,直接或间接的调节糖脂代谢和胰岛素敏感性,这种特殊的细胞因子被称为肝脏因子。Fetuin A、视黄醇结合蛋白4（Retinol-binding protein 4,RBP4）、硒蛋白 P（Selenoprotein P,SeP）都是与胰岛素敏感性密切相关的肝脏因子,在糖脂代谢中也扮演者重要作用。Fetuin A是胰岛素受体（Insulinreceptor,IR）酪氨酸激酶的天然抑制剂,可竞争性的与IRβ结合,抑制IRβ的酪氨酸激酶活化,从而阻止胰岛素引起的IRβ的激活和磷酸化,导致胰岛素抵抗。小鼠注射重组Fetuin A可以降低胰岛素敏感性,而Fetuin A基因敲除的小鼠胰岛素信号传导得到显著的改善。RBP4可以在体外诱导骨骼肌、肝脏和脂肪组织的胰岛素抵抗。RBP4的过表达也同样可以引起胰岛素抵抗,而Rbp4敲除可以增强胰岛素敏感性。高水平SeP与空腹血糖及胰岛素抵抗相关。小鼠注射SeP会引起外周和肝脏的胰岛素抵抗,而肝脏特敲SeP可以改善肝脏和肌肉的胰岛素信号,并改善全身糖耐量。在肥胖及其合并症,诸如T2DM和代谢综合征中均有报道Fetuin A、RBP4和SeP水平的显著升高。目前虽有少数研究报道减重术之后这三种肝脏因子的部分变化情况,但现有的结果存在很多的矛盾。另外,关于这三种肝脏因子在减重手术中起到的作用仍缺乏相关研究。因此,对于减重手术后Fetuin A、RBP4、SeP这三种肝脏因子水平,以及这种变化在减重手术引起的代谢改善中的意义目前仍待进一步的研究。研究目的本研究旨在通过高脂喂养和低剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）注射实验大鼠来建立2型糖尿病模型,对造模成功的大鼠进行DJB手术、SG手术和假手术。探究DJB和SG术后肝脏因子Fetuin A、RBP4和SeP的合成和分泌水平的变化,并进一步分析其在减重手术改善全身代谢中的作用。研究方法1.本研究通过高脂喂养联合低剂量STZ腹腔注射构建2型糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠造模成功后,随机分为假手术组（Sham组）、DJB组和SG组,并分别实施相应手术。术后动态监测各组大鼠体重、摄食量、糖脂代谢相关指标以评估DJB和SG的手术效果。2.术后8周收集外周血检测血清中Fetuin A、RBP4、SeP的水平,并进一步检测肝脏和脂肪组织中Fetuin A、RBP4和SeP的转录水平。3.术后8周收集肝脏、骨骼肌和脂肪组织,检测肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的IRβ的磷酸化水平,以及其下游胰岛素信号通路的激活情况。4.检测肝脏组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）的磷酸化水平和固醇调节元件结合蛋白-1c（Sterol regulatory element-binding protein 1c,Srebp-1c）的 mRNA 水平,并通过 HE 染色、油红染色以及肝脂测定,来判断肝脏中甘油三酯的合成情况。5.检测血清中脂联素的水平、脂肪组织中脂联素的转录水平,以及脂肪组织中的单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）磷酸化的水平,并分析术后脂联素的变化与Fetuin A变化的相关性。研究结果术后SG组大鼠的体重和进食量与其他两组大鼠相比均显著降低,而Sham组和DJB组大鼠的体重和进食量未检测到显著性差异。与Sham组相比,术后DJB组和SG组大鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验和稳态模型评估胰岛素抵抗指数均出现显著改善。与Sham组相比,术后DJB组和SG组的甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TG）和游离脂肪酸（Nonesterified fatty acids,NEFA）水平也显著降低。Fetuin A的血清水平在DJB和SG术后均显著降低,RBP4的血清水平在SG术后降低,DJB术后不变,而SeP的血清水平在Sham组、DJB组和SG组均未观察到显著差异。进一步探究这四种细胞因子合成的变化发现,与Sham组相比,DJB组和SG组肝脏组织中Fetuin A的mRNA表达水平显著降低,但脂肪组织中Fetuin A的mRNA表达水平无显著变化。DJB术后,RBP4在肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平无显著差异,而SG术后检测到脂肪组织中的mRNA表达水平出现显著降低。Sham组、DJB组和SG组的肝脏和肌肉组织中均未发现术后SeP的mRNA的表达差异。DJB和SG术后,大鼠肝脏、骨骼肌和脂肪组织中Fetuin A影响胰岛素信号通路的关键靶点IRβ的磷酸化水平均升高,而总蛋白表达水平无显著性差异。同时,IRβ下游的胰岛素信号通路也得到显著的激活。与Sham组相比,DJB组和SG组肝脏中Fetuin A调节脂代谢的关键分子mTOR的磷酸化水平显著降低,肝脏中Srebp-1c的mRNA水平也显著降低。Srebp-1c下游的甘油三酯合成的关键酶——乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,Acc）、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1（Stearoyl-CoA desaturase 1,Scd1）和脂肪酸合酶（Fattyacidsynthas,Fasn）的mRNA水平也显著降低。HE、油红O染色以及肝脏TG含量检测也证实,DJB和SG手术可以显著降低肝脏中的TG合成和脂质沉积。与Sham组相比,DJB组和SG组脂联素的血清水平显著升高,Spearman分析发现在DJB和SG术后,血清中脂联素的变化与Fetuin A的变化呈负相关。与Sham组相比,DJB组和SG组脂肪组织中脂联素的转录水平显著升高,脂肪组织中调控脂联素合成的关键分子AMPK的磷酸化水平也显著升高。结论1.减重手术可以显著降低血清中Fetuin A水平以及肝脏中Fetuin A合成,且这种降低不依赖与体重的降低。2.减重术后Fetuin A的降低可以通过引起IRβ磷酸化水平的升高,从而引起减重手术后胰岛素信号通路的改善。3.FetuinA的降低可以使mTOR的磷酸化减少,从而抑制Srebp-1c的表达,减少肝脏中甘油三酯的合成。4.减重术后Fetuin A的降低可以通过激活AMPK的磷酸化引起脂联素的表达水平和血清水平的升高。第二部分 DJB和SG手术对FGF21血清水平和FGF21信号通路敏感性的影响研究背景2型糖尿病（Type2 diabetesmellitus,T2DM）是目前全世界最为流行的代谢性疾病之一,对人类的健康有重大威胁。传统的治疗方法,如:药物、饮食控制及生活方式的改变无法有效的控制2型糖尿病及相应的并发症。减重手术近年来广泛应用,取得了良好的手术效果。袖状胃切除术（Sleeve gastrectomy,SG）、Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastricbypass,RYGB）是全球开展最广泛的两种减重手术,而十二指肠空肠旁路术（Duodenal-jejunalbypass,DJB）最初是一种实验性手术,用来研究RYGB肠道重构在改善糖尿病中的作用,具有与RYGB类似的改善糖尿病的作用,但却并不会引起体重的降低。但是,目前对于减重手术改善2型糖尿病的机制尚不清楚,有待进一步的研究。成纤维生长因子 21（Fibroblast growth factor 21,FGF21）是一种 FGF 家族的新型激素,主要由肝脏合成和分泌,具有重要的调节胰岛素敏感性及糖脂代谢的作用。针对人和动物的研究表明,对于肥胖和糖尿病个体注射FGF21或是FGF21的类似物可以降低体重,改善胰岛素敏感性。进一步的研究表明,FGF21在肝脏中可以促进脂肪酸氧化,抑制脂质合成。而在白色脂肪中,FGF21可以抑制脂肪分解。FGF21在β-klotho（KLB）的作用下与其受体成纤维生长因子受体（Fibroblast growth factorreceptor,FGFR）结合,并且磷酸化其下游的细胞外调节蛋白激酶 1/2（Extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）从而激活相应的通路。尽管FGF21可以改善代谢情况,但是血液中的FGF21水平在肥胖和糖尿病中却反常的增高,代表了一种FGF21抵抗的状态。同时也发现,在糖尿病和肥胖状态下,KLB和FGFR在肝脏和白色脂肪中表达降低,并且ERK1/2的磷酸化和相应的下游基因如Egr1和c-Fos的激活也同时受损。关于减重手术后FGF21血清水平的变化,目前已有一定的研究,但是现有的研究相互之间存在矛盾,无法得出一致的结论。而减重手术对FGF21信号通路及其敏感性的作用目前并不明确。研究目的本次实验通过高脂喂养和低剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）注射实验大鼠来建立2型糖尿病模型,然后对实验大鼠进行DJB手术、SG手术和假手术,检测DJB和SG术后FGF21的血清水平变化和肝脏FGF21和合成水平的变化,以及DJB和SG手术对于FGF21敏感性和FGF21信号通路的影响。并进一步探究FGF21敏感性与术后糖脂代谢改善的关系。研究方法1.本研究通过高脂喂养联合低剂量STZ腹腔注射构建2型糖尿病大鼠模型。造模成功后随机分为假手术组（Sham组）、DJB组和SG组,分别实施相应手术,并以普通饮食大鼠作为对照组（Chow组）。术后动态监测各组大鼠体重、摄食量、糖脂代谢相关指标以评估DJB和SG的手术效果。2.术后8周处死大鼠,收集外周血检测血清FGF21的水平,以及FGF21在肝脏、脂肪组织、骨骼肌中的表达。检测肝脏和脂肪组织中KLB、FGFR1、p-ERK1/2、ERK1/2等FGF21信号通路相关分子的蛋白水平。3.术后8周Sham组、DJB组和SG组大鼠腹腔注射人重组FGF21（Recombinenthuma FGF21,rhFGF21）后,检测血脂、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）、胰岛素耐量试验（Insulin tolerance test,ITT）以及肝脏中c-Fos和Egr1的水平变化。4.检测手术后肝脏中糖脂代谢相关分子的变化,以及脂肪组织中脂解相关分子的变化。研究结果术后SG组大鼠的体重和进食量与其他两组大鼠相比均显著降低,而Sham组和DJB组大鼠的体重和进食量未检测到显著性差异。与Sham组相比,术后DJB组和SG组大鼠的全身糖脂代谢相关指标显著改善。与Chow组相比,Sham组血清中的FGF21水平显著升高,而经过DJB与SG手术后,FGF21的水平降低。与Sham组相比,DJB组和SG组肝脏中的FGF21的mRNA和蛋白水平显著降低,而脂肪和骨骼肌中FGF21的mRNA水平四组之间未见明显差异。Sham组肝脏中FGFR1的蛋白水平以及ERK1/2的磷酸化水平与Chow组相比显著降低,而与Sham组相比,术后肝脏中DJB组和SG组的FGFR1和p-ERK1/2蛋白水平显著升高。在脂肪组织中,Sham组与Chow组相比,FGFR1和KLB的蛋白水平以及ERK1/2的磷酸化水平显著降低,与Sham组相比,术后DJB组和SG组的FGFR1、KLB和p-ERK1/2蛋白水平显著升高。rhFGF21腹腔注射后,DJB组和SG组的OGTT和ITT发生相应的改变,而Sham组对rhFGF21无反应。并且在注射rhFGF21后,DJB组和SG组血清的甘油三酯（Triglyceride,TG）和游离脂肪酸（Nonesterified fatty acids,NEFA）的水平降低,肝脏和脂肪组织中Egr1和c-Fos的mRNA水平上调,而Sham组并无显著变化。DJB和SG术后,肝脏中的固醇调节元件结合蛋白-1c（Sterol regulatory element-binding protein 1c,Srebp-1c）、乙酰辅酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,Acc）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase 1,Scd1）和脂肪酸合酶（Fatty acid synthas,Fasn）的mRNA水平与Sham组相比显著降低,肉碱棕榈酰转移酶 1α（Carnitine palmitoyltransferase 1α,Cpt1α）的 mRNA 水平显著升高。而脂肪组织中的激素敏感性脂肪酶（Hormone-sensitivetriacylglycerollipase,Hsl）和脂肪甘油三酯脂肪酶（Adiposetriglyceridelipase,Atgl）的转录水平也显著降低。除此之外,与Sham组相比,DJB和SG术后,肝脏中的糖原含量升高,糖原合酶的蛋白水平显著升高,肝糖异生的关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,Pepck）和葡萄糖-6-磷酸酶（Glucose-6-phosphatase,G6pase）的转录水平显著降低。结论DJB和SG手术后,血清中FGF21的水平以及肝脏中FGF21的表达水平均显著降低,受损的FGF21信号通路出现显著恢复,FGF21的敏感性也得到改善。FGF21敏感性的改善可能是减重手术后糖脂代谢改善的原因之一。