脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）可造成患者严重的运动及感觉功能障碍甚至瘫痪,给患者家庭及社会造成巨大的损失和负担。脊髓损伤的发展过程包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。其中,继发性损伤阶段包括一系列复杂的病理变化,如缺血、缺氧、氧化应激、炎症反应、神经元死亡和脱髓鞘等。复杂的继发性反应导致神经元线粒体功能紊乱及DNA损伤,进而引发细胞死亡。同时,损伤部位微环境的改变抑制了神经元的修复与再生,成为损伤组织修复和重建的最大阻碍。目前临床上仍未有十分有效的治疗方法可彻底治愈脊髓损伤。因此,探索损伤后减少神经元凋亡及促进神经元再生的机制与方法,对于临床上改善及治愈脊髓损伤具有重要意义。近年来,干细胞再生及其生物治疗已成为研究热点,并被广泛应用于临床。其中,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其易得、易培养、低免疫原性等特性被应用于治疗脊髓损伤的研究中。有证据表明,MSCs移植可改善脊髓损伤部位的细胞凋亡、炎症反应,促进神经元再生,是用于脊髓损伤治疗的极具潜能的生物工具细胞。线粒体作为细胞的能量中心,其稳态和生理功能可以决定细胞的命运。我们前期的研究发现骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗脊髓损伤过程中存在线粒体转运现象,且线粒体的转运对受损神经元呈现出更积极的效应。因此,本课题通过进一步研究其产生和转运的调控机制,以期为脊髓损伤的干细胞治疗提供相关研究基础,并探索其可能的内在机制。首先,我们采用线粒体红色荧光染料将BMSCs进行预染色,培养24小时后收集培养基,利用电镜观察和流式检测发现BMSCs可以产生胞外线粒体。将线粒体荧光探针标记过的BMSCs与脊髓前角运动神经元瘤细胞系（VSC4.1细胞）直接培养或利用transwell共培养体系间接培养后,荧光显微镜下观察到VSC4.1细胞中出现红色荧光,表明有BMSCs来源的线粒体转运至VSC4.1细胞中。此外,荧光显微镜观察和统计显示,当BMSCs与氧气-葡萄糖剥夺（OGD）处理后的VSC4.1细胞进行共培养时,被VSC4.1细胞摄入的线粒体含量显著性高于正常VSC4.1细胞。然而,这些BMSCs来源的线粒体是否还具有活性?产能是线粒体的主要功能,ATP含量检测可作为线粒体功能指标之一。我们取BMSCs培养基,并将其中一部分培养基用0.22μm过滤器过滤以除去其中可能存在的线粒体作为对照组。ATP含量检测结果显示正常培养基中ATP含量显著高于对照组,表明胞外线粒体仍具有产能功能。同时,JC-1线粒体膜电位检测结果显示正常培养基中线粒体膜电位高于对照组,表明胞外线粒体仍具有正常膜电位。其次,我们发现当BMSCs与OGD处理的VSC4.1细胞共培养后,BMSCs源性CD157蛋白表达量增高。考虑到CD157可以转导胞内信号调控胞内钙离子,而胞内钙离子水平与线粒体的状态密切相关。我们提出假设:BMSCs上的CD157可能与线粒体的释放和转运有关。我们构建了CD157蛋白的高表达腺病毒载体和sh RNA干扰腺病毒载体,同时以带GFP标签的空载病毒为对照,对BMSCs进行转染。各载体转染后的BMSCs进行24小时培养后,收集各组培养基进行流式检测和荧光强度检测,结果显示CD157高表达组（Over组）培养基中红色荧光阳性率和荧光强度显著高于空载对照组（Mock组）,而sh RNA敲降组（sh RNA组）中二者均低于Mock组,表明胞外线粒体的产生量可能随CD157表达量的增加而增加,提示CD157可能参与调控了BMSCs线粒体释放。转染后的BMSCs与OGD处理的VSC4.1细胞共培养,荧光强度统计结果显示Over组中VSC4.1细胞摄入线粒体的程度显著高于Mock组,而sh RNA组明显低于其他组。共培养后VSC4.1细胞的再生突起长度的统计结果显示,Mock组中神经元突起的长度显著高于OGD损伤组,Over组显著高于Mock组,而sh RNA组显著低于Mock组,表明CD157调控BMSCs线粒体的转移进而可能促进了共培养中受损神经元的轴突再生。再次,我们将转染后的BMSCs与OGD处理的VSC4.1细胞共培养,采用免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法检测共培养后VSC4.1细胞内凋亡相关蛋白的表达。结果显示促凋亡因子Grp78蛋白表达量在Over组中显著下调,促凋亡因子活性NF-κB核内含量在Over组中显著下降,而抗凋亡因子Bcl-xl蛋白表达量在Over组中显著增加。同时,在BMSCs移植脊髓损伤模型大鼠在体实验中,我们取损伤组织切片后进行免疫荧光染色。结果与细胞实验一致,Grp78表达量和NF-κB核内量在Over组中明显下调,而p-Akt和GAP43表达量均于Over组中显著上调。此外,后肢运动能力评估,即BBB评分显示:从术后21天起,Over组大鼠评分开始显著高于Mock组,sh RNA组中大鼠评分显著低于Mock组。综上,BMSCs上CD157的高表达可能上调了线粒体的转移,促进了损伤神经元摄入线粒体,进而抑制了损伤部位的细胞凋亡,促进神经元的修复与再生,最终改善了大鼠的运动功能。最后,我们在细胞水平上对CD157是否通过c ADPR-Ca2+信号通路调控线粒体进行验证。结果表明,CD157确实具有ADPR环化酶活性。而随着产物c ADPR的增加,细胞内线粒体含量、ATP含量和钙离子信号均有所增加。与之一致的是,当CD157的表达量改变时,细胞内的钙离子信号也会随之改变,呈现出钙离子信号随CD157表达量增高而增高的现象。以上证据表明BMSCs上的CD157可能是通过CD157/c ADPR/Ca2+信号通路调控BMSCs产生胞外线粒体并促进其转运的。综上所述,我们可以得出结论:BMSCs上的CD157可能通过c ADPR-钙离子信号通路调控了BMSCs源性线粒体转移至神经元,进而减弱损伤神经元的凋亡,促进神经元的修复与轴突再生,改善运动功能。