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细胞衰老(Cellular Senescence)是细胞发生不可逆的细胞周期停滞、大分子损伤、形成分泌型表型和代谢失调的现象,涉及不同的生理和年龄相关疾病的多种特征。细胞衰老研究大多聚焦于高增殖的细胞,由于细胞增殖引起端粒缩短,进而引起细胞复制性衰老。近期以来,以终末分化细胞神经元为主的脑和视网膜等器官的衰老研究表明,终末分化细胞也可发生细胞衰老,其衰老机制与高增殖细胞不同,其具体机制才刚刚揭示冰山一角。鉴于细胞衰老的复杂性,为了揭示复制性衰老和终末分化神经元的衰老机制,更好的策略是采用多种指标鉴别衰老细胞并研究其机制。研究复制性衰老和神经元衰老的分子机制无疑将为延缓脑衰老提供新思路。癫痫是脑组织中神经元过度兴奋放电引发的突然、短暂和反复发作的一种慢性神经系统功能失常疾病。据统计,全球癫痫患者高达5000万,我国每年约有70万新发病患者。癫痫耐药率较高,治疗预后较差,严重影响患者的身心健康,给患者的家庭和社会带来巨大的负面打击和经济负担。癫痫的发病机制尚不明确,因此开展研究癫痫形成的病理分子机制,对于癫痫的治疗意义重大。扣带回是脑边缘系统的重要构成脑区,下部紧贴并呈带状围绕胼胝体,大脑半球矢状裂合拢处是其内侧面。细胞构筑呈典型的大脑皮层6层结构。扣带回与额叶、颞叶、海马、纹状体、杏仁核、眶区、壳核、胼胝体等脑区都有直接或者间接的投射联系。扣带回与癫痫的发生有关,其发作特点为短暂、刻板、频繁、反复发作且发作的空间和时间会迅速演变。本论文研究聚焦于生长分化因子11(Growth differentiation factor 11,GDF11),又称骨形成蛋白11(Bone morphogenetic protein 11,BMP11)。GDF11 是转化生长因子β-超家族(TGFβ)的新成员之一,参与调控多种器官的胚胎发育过程,在早期胚胎发育过程中起着至关重要的作用。通过异种联体共生手术,使得年轻和年老小鼠的血管融合,从而共用同一个血液循环系统,既往研究工作结果发现,老年小鼠因衰老导致的肌肉萎缩、心肌肥厚和神经功能衰退等老龄化特征均可以因年轻的血液而得到好转,甚至达到年轻的水平。研究者进而通过蛋白质筛选技术发现GDF11在上述逆转衰老的过程中起着关键作用。因此,GDF11一度被认为是一种“返老还童”的蛋白,与衰老和诸多相关疾病有着密切的关系。但是,进一步的研究表明,体外重组rGDF11抑制了老年小鼠的干细胞增殖、抑制了肌肉再生,对老年鼠的心肌肥大无改善作用,得到相反的实验结果。所以,GDF11在再生和延缓衰老的功能方面仍存在着很大的争议。按照增殖能力不同,体内器官可分为高增殖器官和低增殖器官。在高增殖器官和低增殖器官中,内源性的GDF11是否在细胞衰老中发挥作用是一个未知的基本问题。目前认为,成年神经元是丧失增殖能力的终末分化细胞。在低增殖器官中,如脑,已知脑中神经元的衰老与特殊信号通路及线粒体功能衰退等相关。采用免疫荧光技术本论文结果显示,GDF11在成年小鼠大脑皮层如扣带回等处的神经元高表达,且几乎只表达在兴奋性神经元中,并且在丘脑、下丘脑、皮层下核团及脊髓等处广泛表达。采用免疫印迹技术本论文结果揭示,随着年龄增长及衰老,GDF11在脑内的蛋白表达水平逐渐升高。为了探索内源性的GDF11是否在分裂后神经元的衰老中发挥作用,本论文利用CRISPR/Cas9系统特异敲除Neuro-2a细胞系中的GDF11基因,采用单克隆细胞培养技术构建GDF11KO细胞,结果发现GDF11敲除后β-Gal 阳性的衰老细胞显著增多,促神经元衰老蛋白p21的mRNA及蛋白水平显著上升,并且细胞核变大。在电镜下神经分泌颗粒明显增多,溶酶体面积增大,并且位于细胞核的一端,线粒体面积变小,上述结果提示GDF11敲除后引起Neuro-2a细胞衰老,提示GDF11具有对抗衰老的作用。本论文的结果显示,GDF11高度表达于高增殖器官中,如小肠和皮肤等。既往结果表明,GDF11在发育中的中枢神经系统也表达于神经上皮细胞及神经干细胞等高增殖细胞,在中枢神经系统的发育和模式形成中GDF11具有重要作用。内源性GDF11是否在高增殖细胞的复制性衰老中发挥作用是一个未知而有趣的问题。已知高增殖细胞的衰老与端粒有关。端粒位于染色体的末端,由(TTAGGG)n DNA重复序列和结合蛋白组成,并且端粒的长度会随细胞分裂而缩短,而端粒长度的缩短会引起细胞复制性衰老。因此在本论文中,我们通过构建细胞复制性衰老模型(GDF11KO Neuro-2a细胞)来探究GDF11在衰老过程中对端粒的作用。本论文结果表明,GDF11敲除后端粒的平均长度显著缩短,端粒酶Terc和Tert的mRNA表达水平显著降低,端粒酶活性显著下降。以上结果表明GDF11可以通过增强Tert和Terc的表达来提高端粒酶的活性,进而延长高增殖细胞的端粒长度,从而延缓细胞的衰老过程。本论文结果表明,在成年大脑皮层GDF11几乎只表达于皮层兴奋性锥体神经元中,这些成年神经元内源性GDF11是否有病理性功能至今未见报道。为了探索这一问题,本论文自主设计培育了 GDF11fl/fl小鼠,采用Cre-floxp系统进行脑内局部注射CaMKⅡα-Cre病毒以便核团特异敲除GDF11,采用CaMKⅡα-Cre小鼠与GDF11fl/fl小鼠杂交达到细胞类型特异性全敲除 GDF11,通过Dio-EF1α-GDF11-P2A-eGFP病毒注射于CaMKⅡα-Cre小鼠达到过表达GDF11等对GDF11进行分子操作的多种手段,结合行为学、脑片电生理记录、细胞培养、免疫组化、免疫印迹、免疫电镜等技术,我们的结果表明,GDF11表达在成年兴奋性神经元的胞浆、线粒体、轴突、突触前和突触后等部位。在扣带回局部敲除GDF11后记录到自发性癫痫脑电EEG。脑片膜片钳记录结果也表明兴奋性锥体神经元接受的抑制性信号显著减少,兴奋性显著增强。在形态上锥体神经元的树突棘也明显减少。特异敲除全脑兴奋性神经元的GDF11后,成年GDF11cKO小鼠的运动活跃度显著增强。综合上述结果表明,在扣带回兴奋性锥体神经元中特异敲除GDF11引起锥体神经元兴奋性显著增强,进而引发局灶性癫痫。本论文首次发现了内源性GDF11可以延长高增殖细胞的端粒长度,并延缓低增殖细胞的衰老过程,为研究GDF11延缓衰老的分子机制提供了新思路。我们首次发现了 GDF11敲除后可以增强兴奋性锥体神经元的兴奋性,进而导致自发癫痫的发生,发现GDF11是一种新的致癫痫机制,有望创建一种新的癫痫动物模型,为研究自发性癫痫的发病机制及探索新的治疗方法奠定了基础。