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菊糖（inulin）是一种自然界中广泛存在的果聚糖,它能够像淀粉一样为有机体储存能量。当有机体需要能量时,通过降解大分子菊糖为小分子糖来获取能量。菊糖有多种代谢途径,其中一条途径为利用菊糖果糖转移酶（inulin fructotransferase,IFTase）降解菊糖为新型功能性甜味剂双果糖酐（difructose anhydride,DFA）,包括一型双果糖酐（DFA-Ⅰ）和三型双果糖酐（DFA-Ⅲ）。因此,根据这两种产物IFTase被分为一型IFTase（IFTase-Ⅰ）和三型IFTase（IFTase-Ⅲ）。同时,DFA-Ⅲ能被双果糖酐水解酶（DFA-Ⅲ dehydrolase,DFA-Ⅲase）水解为菊二糖（inulobiose）。生物大分子结构决定其功能,酶的特异性结构决定了酶的催化功能。在酶学领域中,酶的结构、功能与催化机制研究是永恒主题。在此基础上,可以进行理性设计、改造甚至是模拟酶,从而获得更高效、更经济的新酶。但目前,这三个酶中只有IFTase-Ⅲ结构被报道,因此,对IFTase-Ⅰ及DFA-Ⅲase结构的研究不仅有助于对它们催化机理和构效关系的理解,也有利于认识这几个酶结构间的差异性,为IFTase和DFA-Ⅲase的理性设计和功能改造提供理论基础。本论文筛选出了新的IFTase-Ⅰ和DFA-Ⅲase,通过晶体结构解析出了它们的催化机理,弄清了IFTase-Ⅰ、IFTase-Ⅲ、DFA-Ⅲase本身以及它们之间的构效关系,同时也从分子水平解释了自然界中菊糖是如何被代谢的。在DFA-Ⅲase结构基础上进行深入研究,理性设计出一个高催化水平的突变体C387A,并通过C387A的晶体结构解析了此催化水平提升的机理,为DFA-Ⅲase进一步的改造奠定了理论基础。主要研究内容和结果如下:1.分离纯化并鉴定Clostridium clostridioforme AGR2157中的一个IFTase-Ⅰ,命名为CcIFTase-Ⅰ。SDS-PAGE和凝胶色谱实验显示其分子量分别为42和128 kDa,表明CcIFTase-Ⅰ为同源三聚体。其最适催化菊糖条件为pH 5.5和50°C,此条件下的酶活为2076 U mg-1,动力学参数Km为0.42 mmol L-1,催化效率kcat/Km为130(mmol L-1)-1 s-1,与已报道的IFTase-Ⅰ相比,CcIFTase-Ⅰ催化效率较高。2.从Arthrobacter aurescens SK8.001中成功调取到DFA-Ⅲase基因,并提交到GenBank保存,登录号为KR534324。构建出含有此基因的质粒pET-22b-AaDFA-Ⅲase,并将其转化至大肠杆菌宿主细胞中表达。将分离纯化出的目的酶命名为AaDFA-Ⅲase。其单亚基分子量和全分子量分别为49 kDa和145 kDa,说明AaDFA-Ⅲase是一种同源三聚体。通过13C-NMR方法测定其催化DFA-Ⅲ的产物为菊二糖,证明了此酶是一种DFA-Ⅲase。其最适催化条件为pH 5.5和55°C,此条件下的酶活为232 U mg-1,Km为30.7 mmol L-1。同时,通过同源建模、分子模拟对接和定点突变技术对AaDFA-Ⅲase结构、催化中心和关键催化残基进行了初步探究。研究表明AaDFA-Ⅲase和IFTase-Ⅲ的活性中心残基完全一致,只是AaDFA-Ⅲase活性中心上方多出一个盖子,说明两者存在一定的进化关系。3.分离纯化并鉴定Arthrobacter chlorophenolicus A6中的一个DFA-Ⅲase,命名为AcDFA-Ⅲase。其最适反应条件是55°C和pH 6.5,此条件下的酶活为101.25 U mg-1。在20°C条件下,对此酶进行结晶实验,结晶试剂最终筛选为0.1 mol L-1丙二酸钠（pH4.2）,6%的聚乙烯乙二醇3350（PEG 3350）（W/V）。通过X射线进行晶体衍射数据收集,最终解析出AcDFA-Ⅲase裸蛋白结构以及AcDFA-Ⅲase和其底物DFA-Ⅲ的复合物结构。结果表明AcDFA-Ⅲase与已报道的IFTase-Ⅲ结构十分相似,只是AcDFA-Ⅲase活性中心上方多出一个盖子。结合生化实验,推测了AcDFA-Ⅲase催化DFA-Ⅲ的机理,其主要采用的是一种典型的反转水解机制。同时,研究发现AcDFA-Ⅲase能降解菊糖为DFA-Ⅲ和菊二糖,这是首次发现DFA-Ⅲase具有催化菊糖功能,与先前的报道相反,表明DFA-Ⅲase具有IFTase-Ⅲ活性。此过程中,AcDFA-Ⅲase首先将菊糖降解为DFA-Ⅲ,然后利用其本身的水解活性将DFA-Ⅲ进一步水解为菊二糖,这也说明了AcDFA-Ⅲase具有连续催化菊糖功能。AcDFA-Ⅲase与菊糖型底物GF2复合物结构表明AcDFA-Ⅲase活性中心残基以及底物状态与IFTase-Ⅲ中的完全相同。此外,删除AcDFA-Ⅲase盖子后,AcDFA-Ⅲase丧失水解DFA-Ⅲ能力,这种去除盖子酶的整体结构、活性中心残基及底物状态与IFTase-Ⅲ中的相同。这些结果表明AcDFA-Ⅲase和IFTase-Ⅲ催化菊糖所采用的机理是一致的。4.由于AcDFA-Ⅲase的催化效率很低,基于解析出来的结构对其进行理性设计。其中盖子区域上387位点的Cys387残基位于盖子最前端和底物分子的正上方,将此位点残基突变为Ala387之后,突变体C387A的相对酶活提高到了185%。解析出来的C387A结构显示由于Ala387侧链相较于Cys387的更短,使得底物分子至盖子区域空间变大,底物分子更容易上升而被水解,从而导致催化效率提高。5.将CcIFTase-Ⅰ进行结晶,最终筛选的结晶条件为:0.45 mol L-1酒石酸铵（ammonium tartrate dibasic）,0.1 mol L-1三水（合）乙酸钠（sodium acetate trihydrate）,pH为4.45,温度为20°C。解析出来的晶体结构显示CcIFTase-Ⅰ与IFTase-Ⅲ整体结构非常相似,活性口袋在相同位置,关键催化残基位置和构象完全相同,只是起辅助作用的活性残基有差别。这种差异性可能导致了底物分子的朝向不同,使得最终产物分别为DFA-Ⅰ和DFA-Ⅲ。