【摘 要】
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缺血/低氧预适应(I/HPC)是组织对缺血/低氧刺激产生的一种内源性保护现象,即给予轻、中度缺血/低氧性预刺激,组织器官或细胞会对随后继发重度持续性缺血/低氧损伤产生一定的耐
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缺血/低氧预适应(I/HPC)是组织对缺血/低氧刺激产生的一种内源性保护现象,即给予轻、中度缺血/低氧性预刺激,组织器官或细胞会对随后继发重度持续性缺血/低氧损伤产生一定的耐受。脑I/HPC诱发的神经保护为临床上防治脑缺血/低氧性损伤及其相关疾病提供了重要思路。因此,脑I/HPC细胞分子机制的研究一直是国内外学者关注的热点,但目前人们对于脑I/HPC形成机制的认识尚不清楚。我们以往的研究表明,蛋白激酶C(PKC)家族12个成员中,cPKCβ II和γ,以及nPKCε等亚型及其下游作用底物神经颗粒素(Ng)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)参与早期脑HPC的形成过程,但在该过程中细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)的磷酸化水平却明显降低。因此,核糖体S6激酶(RSK)作为PKC和ERK1/2下游的重要激酶,是否参与了脑HPC的细胞信号转导通路?参与脑HPC形成的nPKCε功能复合物中包含哪些激酶或蛋白分子,其中哪些蛋白在低氧过程中发生变化,这些问题都有待进一步明确。
实验选用成年雄性BALB/c小鼠,体重18~22g。将实验动物随机分为正常对照组(H0)、重复性低氧1~4次(早期低氧预适应,H1~H4)和重复性低氧5、6次(延迟性低氧预适应,4次重复性低氧小鼠恢复24h后,再进行第5和6次低氧,即H5和H6)等7组。低氧结束后,迅速分离小鼠大脑皮层和海马组织,一部分组织用于提取胞浆和膜相关蛋白组分,应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)以及免疫组化等技术方法,观察了重复低氧刺激下,小鼠大脑皮层和海马组织内RSK膜转位水平和蛋白表达量的变化;并对比了不同的RSK磷酸化位点(PDKl的激活位点Ser227和ERK1/2的激活位点Thr359/Ser363)磷酸化水平的差异;同时应用免疫组化技术印证了上述结论,并明确了RSK被磷酸化激活的细胞类型。此外,还有一部分组织提取胞浆和核蛋白组分,应用功能蛋白质组学的方法,如免疫沉淀、蛋白印迹、双向电泳和银染等技术,对nPKC£功能复合物进行初步分离,寻找脑HPC前后的差异蛋白带/点。实验数据通过One way ANOVA或T-test进行统计学检验,以均数±标准误(X±S.E.)表示,其中P<0.05具有显著性。
本实验初步探讨了RSK在脑HPC发生发展过程中的作用,初步确定重复低氧可能通过PDKl依赖的信号转导通路,使RSK的Ser227位点磷酸化水平增高,引发RSK膜转位,参与脑HPC的发生发展过程。本实验还应用功能蛋白质组学的方法对参与脑HPc的nPKCε功能复合物进行初步分离,发现了一些与nPKC~相结合并且共同参与脑HPC的蛋白,为后续蛋白的分离、提纯和鉴定奠定良好的基础。研究将深化对脑HPC发生发展的分子机制、信号转导通路的构成及各通路之间的相互作用关系的认识,为低氧性脑损伤相关的高原医学、航天医学及临床医学等领域开发新药提供科学的实验依据。
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