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研究目的和意义:宫颈癌具有发病率高、致死率高以及发病年龄趋于年轻化的特点,严重威胁女性的身心健康。近年来,我国宫颈癌发病率呈上升趋势,宫颈癌的防治作为公共卫生问题已引起中国政府的高度重视和关注。在诸多治疗宫颈癌的疗法中,光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种在肿瘤治疗方面有着广阔前景的新型疗法,该疗法是一种联合光、光敏剂和组织中氧分子,通过光动力学反应选择性破坏病变组织以达到治疗目的的无创或微创治疗技术,具有对病变部位造成创伤和毒副作用小、定位精准、治疗时间短、操作简便、价格低廉等优点。对于大多数组织而言,PDT作用深度均可满足治疗需求;而宫颈部位表浅,易暴露,局部给药和光照治疗均十分方便,从而使得PDT在治疗宫颈病变方面更具优势。此外,PDT在保留器官完整的前提下,还可行多次重复治疗,清除残余病变组织,对于彻底根治病变直径大于3cm和累及宫颈腺腔深度超过2.5cm的病变,更加突显治疗优势。同时,经PDT治疗后,女性的生育功能未受破坏,能满足年轻患者对保留生育能力的需求。PDT治疗成功的关键在于使用理想的光敏剂。临床中已使用的前几代光敏剂由于其成分复杂,易受生物代谢影响,光敏损伤作用的程度不易控制,且多次使用会出现毒副作用和耐受性,因而限制了 PDT治疗作用的发挥。目前,新一代光敏剂正在研发之中,不少中药单体(如姜黄素、黄芩苷等)具有较好的光敏性。本团队前期开展了中药单体姜黄素介导PDT治疗宫颈癌的研究,证实了姜黄素介导PDT治疗宫颈癌具有一定的疗效。而黄芩苷具有明显的抗病毒、抗炎、抗肿瘤以及治疗相关妇科疾病等功效,因此我们猜想黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌会有优于姜黄素的疗效,黄芩苷有望成为一种高效、低毒且具有多重抗肿瘤作用的新型光敏剂。因此,本实验拟采用黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌,观察该疗法对肿瘤组织的抑制作用,并初步探讨其可能的抑瘤机制是否与促进癌细胞凋亡有关。本研究分为两个部分,实验一:建立宫颈癌体外移植瘤模型,给予相应治疗,通过各组肿瘤体积的变化及抑瘤率的对比,观察黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌的疗效,同时初步筛选出黄芩苷的最佳作用浓度;通过HE染色,进一步从组织病理学改变观察该疗法的疗效。实验二:进一步探讨黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌体外移植瘤的作用机制。通过建立体外移植瘤模型,采用免疫组化和Western blot方法检测移植瘤组织中Bcl-2、Bax和Cyt-C蛋白的分布及表达情况;探讨黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌体外移植瘤的相关凋亡机制是否与Bcl-2/Bax/Cyt-C凋亡途径有关。方法:1.黄芩苷介导光动力疗法对宫颈癌体外移植瘤的疗效观察将Hela细胞接种于BALB/c裸鼠背部皮下,制作宫颈癌体外移植瘤模型。造模成功后,将荷瘤小鼠随机均匀分为模型组、高浓度黄芩苷-PDT治疗组、中浓度黄芩苷-PDT治疗组、低浓度黄芩苷-PDT治疗组、姜黄素-PDT治疗组和PDT治疗组,每组12只。PDT治疗组:予肿瘤周围注射100μL生理盐水,6小时后瘤周注射硼砂缓冲液0.01mol/L 100μL,行PDT治疗,照射剂量80J/cm2(435nm波长,0.60A,0.54W,距离肿瘤表面3-5cm,照射2min28s)。;高、中、低浓度黄芩苷-PDT治疗组:分别以80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL不同浓度的黄芩苷溶液代替生理盐水,其他同PDT治疗组;姜黄素-PDT治疗组:以50μmol/L的姜黄素溶液代替生理盐水,其他同PDT治疗组;模型组:以自然光照代替PDT治疗,其他同PDT治疗组。治疗1天后,各组随机取6只裸鼠取材制作石蜡切片,通过HE染色观察肿瘤组织病理学改变。其余6只裸鼠分别于治疗第1、3、7、14天测量肿瘤体积,计算肿瘤体积抑制率,明确黄芩苷介导PDT治疗宫颈癌体外移植瘤疗效。2.黄芩苷介导光动力疗法治疗宫颈癌的作用机制研究将Hela细胞接种于BALB/c裸鼠背部皮下,制作宫颈癌体外移植瘤模型。造模成功后,将荷瘤小鼠随机均匀分为模型组、黄芩苷-PDT治疗组、PDT治疗组、姜黄素-PDT治疗组,每组12只。PDT治疗组:予肿瘤周围注射100μL生理盐水,6小时后瘤周注射硼砂缓冲液0.01mol/L 100μL,行PDT治疗,照射剂量80J/cm2(435nm波长,0.60A,0.54W,距离肿瘤表面3-5cm,照射2min28s);黄芩苷-PDT治疗组:以实验一筛选出的最优浓度的黄芩苷溶液(80μg/mL)代替生理盐水,其他同PDT治疗组;姜黄素-PDT治疗组:以50μmol/L的姜黄素溶液代替生理盐水,其他同PDT治疗组;模型组:以自然光照代替PDT治疗,其他同PDT治疗组。治疗1天后取材,采用免疫组化和Western blot方法检测移植瘤组织中Bcl-2、Bax和Cyt-C蛋白的分布及表达情况;探讨黄芩苷介导光动力疗法治疗宫颈癌体外移植瘤的相关凋亡机制是否与Bcl-2/Bax/Cyt-C凋亡途径有关。结果:1.黄芩苷介导光动力疗法对宫颈癌体外移植瘤具有治疗作用,其中以高浓度黄芩苷(80μg/mL)疗效最佳,效果优于姜黄素介导光动力治疗组。1.1肿瘤体积变化结果模型组肿瘤体积呈现逐渐增大的趋势。各治疗组肿瘤生长受到不同程度抑制,体积在治疗后1-3d保持不变或略减小,3d后体积逐渐增大;与模型组相比,治疗第14天后,高浓度黄芩苷-PDT治疗组和姜黄素-PDT治疗组肿瘤体积均有极显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),其余各治疗组肿瘤体积有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。与PDT治疗组相比,治疗第14天后,高浓度黄芩苷-PDT治疗组肿瘤体积显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),其余各治疗组肿瘤体积有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。1.2肿瘤体积抑制率变化结果给予治疗后1-3天,高浓度黄芩苷-PDT治疗组和姜黄素-PDT治疗组抑瘤率升高,且高浓度黄芩苷-PDT治疗组抑瘤效果显著,明显优于姜黄素-PDT治疗组,其余各治疗组抑瘤率均呈下降趋势;而治疗后7-14天,各组抑瘤率均呈下降趋势,但高浓度黄芩苷-PDT治疗组抑瘤率高于其余各组。1.3组织病理学结果光学显微镜下可见:模型组肿瘤细胞成分相对单一,呈团巢状排列,细胞大小不等,边界不清,呈圆形或卵圆形,核浆比增大,染色质粗糙,核分裂像常见,偶见坏死。与模型组相比,其余各治疗组可见坏死灶,灶内细胞核固缩,胞浆嗜酸性变,坏死灶周围肿瘤组织细胞排列较稀疏,体积缩小,核分裂象较模型组减少,其中以高浓度黄芩苷-PDT治疗组最为明显,姜黄素-PDT治疗组比较明显。此外,高浓度黄芩苷-PDT治疗组治疗区域肿瘤组织坏死面积大于其余治疗组;而姜黄素-PDT治疗组肿瘤组织内可见出血现象。2.黄芩苷介导光动力疗法治疗宫颈癌体外移植瘤的相关凋亡机制与Bcl-2/Bax/Cyt-C凋亡途径有关。2.1免疫组化结果:Bcl-2、Bax和Cyt-C蛋白表达均分布于细胞胞质内,呈棕黄色。2.1.1 Bcl-2:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组、姜黄素-PDT治疗组及PDT治疗组Bcl-2表达均极显著降低(P<0.01);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄岑苷-PDT治疗组Bcl-2表达结果无统计学差异(P>0.05)。2.1.2 Bax:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组与姜黄素-PDT治疗组Bax表达极显著增加(P<0.01),PDT治疗组Bax表达显著增加(P<0.05);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄芩苷-PDT治疗组Bax表达结果无统计学差异(P>0.05)。2.1.3 Cyt-C:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组、姜黄素-PDT治疗组及PDT治疗组Cyt-C表达均极显著增加(P<0.01);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄芩苷-PDT治疗组Cyt-C表达结果无统计学差异(P>0.05)。2.2 Western blot 结果:2.2.1 Bcl-2:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组与姜黄素-PDT治疗组Bcl-2表达极显著降低(P<0.01),PDT治疗组Bcl-2表达显著降低(P<0.05);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄芩苷-PDT治疗组Bcl-2表达结果无统计学差异(P>0.05)。2.2.2 Bax:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组与姜黄素-PDT治疗组Bax表达极显著增加(P<0.01),PDT治疗组Bax表达无统计学差异(P>0.05);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄芩苷-PDT治疗组Bax表达结果无统计学差异(P>0.05)。2.2.3 Cyt-C:治疗1天后,与模型组相比,黄芩苷-PDT治疗组、姜黄素-PDT治疗组以及PDT治疗组的Cyt-C表达均极显著升高(P<0.01);与姜黄素-PDT治疗组相比,黄芩苷-PDT治疗组Cyt-C表达结果无统计学差异(P>0.05)。结论:1.黄芩苷介导光动力疗法对宫颈癌细胞可以发挥抑制作用,以高浓度黄芩苷介导光动力疗法为最佳,且其整体疗效优于姜黄素介导光动力疗法;2.黄芩苷介导光动力疗法治疗宫颈癌体外移植瘤发挥抑瘤作用可能与Bcl-2/Bax/Cyt-C相关凋亡通路有关。