植物基因组DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传学标志，在基因表达、细胞分化及植物生长发育过程中均发挥着重要的调节作用。目前对植物基因组DNA甲基化的研究大多是依靠与甲基化通路相关的突变体，或是通过抑制DNA甲基化建立的化学物质，这往往造成基因组大范围的甲基化水平变化。那么这些方法在研究植株体内特定基因的甲基化时就存在局限性。最近有报道利用基于CRISPR/dCas9的去甲基化系统SunTag–TET1cd在拟南芥中靶向降低了目的基因的DNA甲基化水平，这为研究植物基因组DNA的甲基化提供了新的思路。但若是要在植物中广泛应用还是有所限制的，因为CRISPR/Cas9系统的应用，受到Cas蛋白原型间隔区相邻基序(PAM)的限制。目前常用的Ⅱ型Cas蛋白SpCas9只能识别NGGPAM，这就限制了该系统在植物中的应用范围。而CRISPR/Cpf1基因编辑系统所利用的核酸酶Cpf1与其它、Ⅱ型蛋白有着很大的不同，其中期PAM识别位点为富含胸腺嘧啶的-TTTN。
　　本研究以模式植物拟南芥Col-0生态型作为实验对象，利用SunTag系统的原理，将失去核酸酶活性的dCpf1分别同DNA去甲基化蛋白结构域TET1cd和ROS1cd融合表达，从而构建拟南芥体内的定点去甲基化编辑器，选取拟南芥基因组内高度甲基化的FWA基因启动子和转座子CACTA1设计靶sgRNA，实现了靶位点DNA的定向去甲基化。主要研究结果如下：
　　1.构建基于CRISPR/dCpf1系统的拟南芥体内的定点去甲基化编辑器
　　首先利用点突变的方法分别将LbCpf1和AsCpf1突变成无核酸酶活性的dLbCpf1和dAsCpf1。本课题中设计的去甲基化编辑系统从结构上可分为三部分：第一部分由RPS5A启动子驱动dCpf1及后面串联的多个GCN4结构，GCN4之间分别用14和22个氨基酸的linker进行连接；第二部分由RPS5A启动子驱动连接有scFv结构的DNA去甲基化蛋白催化结构域，分别选用人类中的DNA去甲基化蛋白TEN-ELEVENTRANSLOCATION1(TET1)的催化结构域TET1cd和拟南芥中的去甲基化蛋白REPRESSOROFSILENCING1(ROS1)的催化结构域ROS1cd；第三部分是AtU6启动子驱动的sgRNA。综上，将两种dCpf1、两种不同的linker和两种DNA去甲基化蛋白结构域进行组合，共构建了8种不同类型的DNA去甲基化编辑载体，其载体骨架分别为14dAsCpf1-TET1cd、22dAsCpf1-TET1cd、14dLbCpf1-TET1cd、22dLbCpf1-TET1cd、14dAsCpf1-ROS1cd、22dAsCpf1-ROS1cd、14dLbCpf1-ROS1cd与22dLbCpf1-ROS1cd。针对拟南芥的基因FWA和转座子CACTA1的启动子附近各设计一个sgRNA，分别连接到上述8种载体上。
　　2.去甲基化编辑系统靶向降低拟南芥靶位点附近甲基化水平
　　利用浸花法将针对FWA和CACTA1位点的DNA去甲基化编辑载体转化拟南芥获得相应的转基因植株。与野生型Col-0相比，T1转基因植株FWA和CACTA1靶位点甲基化水平下调，并且TET1cd的编辑效率比ROS1cd高。然而linker和dCpf1的类型对DNA靶向去甲基化编辑效率的影响，则与去甲基化蛋白的种类和靶点类型有关。在CACTA1相关转基因拟南芥中，以TET1cd为去甲基化效应元件时，用14-aalinker的编辑效率比22-aalinker高，并且dAsCpf1的作用效果比dLbCpf1好，但在以ROS1cd为去甲基化效应元件时，用22-aalinker编辑效率比14-aalinker高，dLbCpf1的效果反而强于dAsCpf1。在FWA相关转基因拟南芥中,22-aalinker的编辑效率高于14-aalinker，以TET1cd为去甲基化效应元件时，dLbCpf1的编辑效率高于dAsCpf1，而以ROS1cd为去甲基化效应元件的时，dAsCpf1的编辑效率高于dLbCpf1。
　　3．转基因拟南芥靶位点DNA甲基化的改变可遗传给后代
　　对靶向CACTA1位点的四种编辑载体的转基因的T2与T3植株的DNA甲基化水平进行分析，发现无论转基因植株后代中含还是不含T-DNA，其CACTA1位点的DNA甲基化水平都低于野生型Col-0。表明这种去甲化效应可以通过有性生殖传递到后一代。
　　综上所述，本研究开发的基于CRISPR/Cpf1的DNA靶向去甲基化系统可有效的降低靶位点附近的甲基化水平且能遗传给下一代，这不仅拓宽了植物DNA靶向去甲基化系统的应用范围，同时也将为开发优良性状的表观等位基因提供新的工具。