论文部分内容阅读
精子发生与成熟是影响哺乳动物繁殖效率的主要因素之一。睾丸曲细精管中,雄性生殖细胞经历一系列分化步骤及形态变化形成成熟的雄性配子,此过程通常伴随着表观修饰的调控。组蛋白赖氨酸去甲基化酶是表观修饰的调节因子之一,参与配子形成及胚胎发育等过程。前期研究表明,多个KDMs家族成员参与精子发生及胚胎发育。KDM2A是KDMs家族成员之一,可通过调节H3K36甲基化水平和相关信号通路的表达,对细胞增殖、分化、凋亡和衰老起调控作用,进而影响发育和肿瘤形成。然而,目前关于KDM2A对于精子发生晚期的影响还未见报道。因此,本研究通过qRT-PCR(Real-time quantification PCR,qRT-PCR)、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等技术分析KDM2A在睾丸和精子发育中的表达规律,并利用Cre-loxP系统建立精子细胞KDM2A特异性敲除小鼠模型;通过HE染色、体外受精、交配实验以及统计学分析方法比较KDM2A敲除后小鼠睾丸发育、精子成熟以及生育能力的表型变化。结果如下:1.对KDM2A进行组织表达谱分析发现,该基因mRNA在睾丸中高表达,且在睾丸发育中KDM2A的表达呈动态分布,其在睾丸发育前期的表达迅速升高,之后维持相对稳定;2.免疫组化结果显示,睾丸中KDM2A蛋白主要定位于支持细胞及除伸长形精子细胞之外的各级生精细胞中;免疫荧光结果显示,KDM2A蛋白主要定位于精子尾部;KDM2A蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达趋势与qRT-PCR结果吻合;3.建立敲除小鼠模型结果显示,成功获得精子细胞KDM2A特异性敲除(KDM2A cKO)小鼠,qRT-PCR和免疫组化技术等结果显示,敲除效率较高,与对照组差异极显著(P<0.01);4.睾丸形态及组织结构比较结果显示,KDM2A cKO小鼠的体重、睾丸重量、睾丸系数、睾丸形态大小、组织结构、生精进程以及精子细胞数量与对照组相比,均无显著差异(P>0.05);5.精子计数及IVF试验结果显示,KDM2A cKO小鼠附睾的精子数量与KDM2Afl/fl小鼠相比略有降低,但无统计学意义(P>0.05),单个精子形态也无显著异常;将精子进行体外受精发现,受精卵的卵裂率与囊胚率均与对照组无明显差别(P>0.05),揭示精子细胞KDM2A特异性敲除后对小鼠精子数量、质量和体外受精能力无显著影响(P>0.05);6.交配实验结果显示,与对照组相比,KDM2A cKO雄鼠的平均产仔数和窝数均有下降,但无统计学差异(P>0.05),表明KDM2A敲除后对雄性小鼠生育能力无显著影响。综上,本试验检测了KDM2A在小鼠睾丸发育及精子成熟过程中的表达谱及亚细胞定位;成功建立了KDM2A特异性敲除小鼠模型,获得精子细胞KDM2A cKO小鼠;通过对KDM2A cKO与KDM2Afl/fl小鼠的睾丸、精子、生育能力等方面检测发现两者均无显著差异,即KDM2A敲除后,雄性小鼠的生殖功能无明显变化。由此推测KDM2A在精子发生前期起重要调控作用,而在精子形成阶段可能不是必不可少的。此外,也可能是由于KDM2A蛋白的H3K36me1/2去甲基化功能在精子发生后期被其亚家族另一成员KDM2B蛋白所替代。因此,采用多基因敲除,即将其亚家族另一成员KDM2B同时在精子细胞中敲除的方法,来探讨该类蛋白的生物学功能及其对精子发生和雄鼠生育能力的影响是较好的途径。