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耐盐嗜碱菌Halomonas sp.Y2分离自富含Na+的强碱性(pH>11.0)造纸废液。基因组测序结果显示该菌具有四种Na+/H+逆向转运蛋白:NhaD1、NhaD2、NhaP和Mrp。对不同pH(6.21、8.0、10.17)条件下进行转录组分析,发现该菌在不同条件下可以利用多种转运系统来维持细胞内外酸碱平衡。与酸性条件相比,该菌株基因组预测的四个编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因在酸性或碱性条件下表现出明显的差异性表达。课题组前期对这四种蛋白进行了异源表达,初步验证了这些转运蛋白的功能特性。为进一步确定这些转运蛋白在该菌中的生理功能,本文对其进行了基因敲除实验,结果进一步证明了这四种转运蛋白在耐受盐碱环境时是以分工合作的方式发挥作用的。其中,Ha-NhaD2在E.coli KNabc中表现了强大的Na+(Li+)转运能力。敲除菌株Halomonas sp.Y2/⊿nnhaD2在高Na+(Li+)、不同pH条件下的生长均受到抑制,表明NhaD2在维持细胞离子平衡和酸碱平衡方面的重要作用。然而,Ha-NhaD1的敲除菌株Halomonas sp.Y2/⊿nhaD1的耐盐碱性表明其在耐盐碱方面具有较弱的生理功能。Ha-Mrp在离子转运方面综合了嗜碱芽孢杆菌与中性菌的转运性质,不仅具有突出的Na+(Li+、K+)转运能力,且在维持酸碱平衡方面表现出与嗜碱芽孢杆菌的Mrp类似的关键作用。敲除菌株Halomonas sp.Y2/⊿mrpF在高pH、高Na+(Li+、K+)浓度条件下表现出了明显的生长抑制。而Ha-NhaP的敲除也证明了其在K+转运方面的能力,敲除菌株Halowmonas sp.Y2/⊿nhaP在高K+浓度、不同pH条件下均表现出了生长抑制。为进一步验证Ha-Mrp在高pH条件对K+的转运功能,深入阐述Halomonas sp.Y2中K+的转运机制,通过基因组注释结果发现四种K+外排蛋白:Potassium efflux system KefA protein/Small-conductance mechanosensitive channel(KE1)、Potassium efflux system KefA protein/Small-conductance mechanosensitive channel(KE2)、Glutathione-regulated potassium-efflux system ATP-binding protein(KE3)和 Potassium efflux system KefA protein/Small-conductance mechanosensitive channel(KE4)。在40 mMNaCl、不同pH和不同KC1浓度条件下的生长验证表明,仅敲除了 Ha-KE1的缺陷菌株在不同pH条件下均表现出了生长抑制,其产生的生长抑制强度与敲除菌株Halomonas sp.Y2/⊿nhaP相近;另外,在高pH条件下敲除菌株Halomonas sp.Y2/⊿mrpF的生长抑制最为明显。在40 mM NaCl、高浓度KC1(1.6 M)的条件下额外加入不同浓度的NaCl,生长结果表明pH 8条件下除Halomonas sp.Y2/⊿ke1外,其他敲除菌株均基本解除生长抑制。然而,在pH 10条件下,除Halomonas sp.Y2/⊿mrpF外,其余敲除菌株均表现出与野生菌一致的生长状态。这种加入NaCl后敲除菌株的生长抑制得到解除的现象表明NaCl对K+的外排具有促进作用,即Halomonas sp.Y2中可能存在Na+/K+协同转运的机制。在高pH条件下,敲除Mrp的缺陷菌株Halomonas sp.Y2/⊿mrpF仅在低浓度NaCl下恢复生长,而具有Mrp的其他缺陷型菌株在加入NaCl后都恢复生长。因此,我们猜测在Halomonas sp.Y2的Na+/K+协同转运过程中Mrp同样扮演了重要作用,即Mrp可能具有这种Na+/K+-couple转运功能。对Halomonas sp.Y2中K+外排相关蛋白基因进行了荧光定量分析,结果表明在高pH、不同NaCl条件下,mrpA和mrpG在高K+浓度的条件下都表现出较为明显的上调;nhaP在pH 8的条件下上调明显。结果进一步表明在高pH条件下Mrp发挥主要K+的转运功能,而在pH 8条件下则是NhaP发挥主要转运功能。以上结果均说明了在高pH条件下Ha-Mrp在pH稳态及K+转运方面的重要作用,为进一步揭示Ha-Mrp对K+转运的机制,本文选择其中的MrpA亚基进行关键位点功能分析。相关研究表明,酸性氨基酸经常作为离子结合的重要位点,因此根据多序列比对结果首先在Ha-MrpA上选取了 5个相对保守的酸性氨基酸位点:MrpA-G103E、-A233E、-N292E、-E540D 和-D682N 进行定点突变。突变后,仅233位点(Ala突变为Glu)保留了 Na+/Li+转运能力而丧失了 K+的外排作用。其他酸性氨基酸的突变均导致Ha-Mrp的Na+/Li+/K+外排能力明显减弱。MrpA-A233E使Ha-Mrp的外排的底物谱与嗜碱菌一致,这说明233位点可能为Mrp转运底物差异的重要位点。另外,在有无K+外排作用的MrpA上选取分别保守的氨基酸位点 MrpA-A30L、-S67N、-F131Y、-Q160K、-F226I、-Q558M 和-R666H进行突变并检测生长互补能力。其中,MrpA-S67N、MrpA-F2261和MrpA-Q558M在Na+胁迫下的生长与阳性对照相比没有发生抑制,但K+(Li+)/H+转运能力明显减弱,说明Ha-MrpA-Ser-67、-Phe-226和-Gln-558可能是Li+(K+)结合的重要位点。MrpA-R666H的突变体生长结果显示其具有Na+转运能力及较为明显的Li+转运能力,但K+转运能力明显减弱(可能消失)。666位点的Arg突变为His也使Ha-Mrp的转运底物向嗜碱菌靠拢,这说明Ha-MrpA-R666也可能是影响Mrp转运底物的重要位点。