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病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是一种由病毒感染引起的常见心脏疾病。本病的表现差异很大,可从无症状到心力衰竭,猝死等,取决于感染病毒的类型,宿主基因特性,病变的程度和部位,外界环境等因素。其中猝死多见于儿童,青少年,运动员等,常无明显的病毒感染前期症状。猝死(suddendeath,SD)是指貌似健康或症状不明或病情稳定的人由于体内潜在的器质性病变或机能突然改变而发生的意料不到突然的自然死亡,通常在发病内24小时死亡,甚至于1小时内死亡,是临床及法医尸检中常见的现象。由于病毒性心肌炎作为由病毒感染引起的心脏病近些年在儿童和青少年中的发病率呈逐年上升趋势,已逐步成为儿童青少年猝死的一个重要原因,因此对病毒性心肌炎猝死的研究引起了人们极大的关注,特别是在病原学的定位、病理形态学以及心肌炎的治疗方面,已获得了一些研究成果,但有关心肌炎以及心肌炎猝死的发病机制至今尚不清楚。其中作为研究热点,钠、钾、钙等离子通道的异常,通道调节蛋白的异常是认为引起心率失常从而导致猝死的重要机制,其中Ca2+离子流的异常显得尤为关键,与Ca2+调节、贮存、释放、转运等相关蛋白有关。如钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的过表达导致Ca2+内流的明显减少,从而影响窦房结和房室结去极化的延迟,传导减慢,引发心电产生异常及传导紊乱最终导致传导阻滞甚至猝死的发生。心钙释放通道基因(RyanodineReceptor,RyR2)突变可导致室性心动过速和猝死,当心肌细胞兴奋时,细胞膜上电压依赖性L型钙通道被激活,其产生的钙内流,激活了肌质网RyR2产生钙火花,而大量钙火花总和产生了钙瞬变,从而启动心肌细胞收缩过程。如果RyR2蛋白改变,意味着潜伏期延长,分子间耦联概率下降,从而触发钙释放的去同步化。
目前关于心肌炎猝死机制的研究的文献报较多,但机理尚不完全清楚,而且在法医学实际工作中,心肌炎猝死的机制一直未能得到圆满解释,因此拟通过动物实验的方法模拟心肌炎猝死的发生,并对心肌炎猝死过程中的心电蛋白RyR2和CRT变化进行探讨,进一步研究猝死发病机制。本研究第一步是利用动物实验方法建立心肌炎及猝死模型,通过注射病毒制备心肌炎小鼠模型,通过力竭性运动实验制备心肌炎小鼠猝死模型;第二步是利用免疫组织化学和核酸原位杂交技术从蛋白和mRNA水平检测RyR2、CRT基因在正常小鼠心肌组织、心肌炎组小鼠心肌组织和猝死组小鼠心肌组织中的表达情况,探讨RyR2、CRT在这些组织的表达特点及作用意义。研究结果如下:
1.动物模型通过对比分析初步研究了力竭性运动与病毒性心肌炎猝死的关系,结果表明力竭性运动可导致病毒性心肌炎小鼠在运动后较短时间内的死亡率明显上升,诱发猝死的发生(心肌炎力竭性运动组小鼠的猝死率高达47.83%,高于非运动组的11.76%);正常组小鼠在运动前后心室率增快,PR间期下降,而心肌炎小鼠运动前后心室率变慢,PR间期延长,表明心肌炎小鼠的心肌收缩功能已经明显出现障碍,心肌功能很难正常适应运动中的心脏负荷变化;同时用L-420E生物机能实验系统动态监测显示心肌炎小鼠运动后峰值电位明显下降(正常小鼠运动前后的峰峰值由0.88mv上升到0.90mv,心肌炎小鼠运动前后的峰峰值由1.2lmv下降到0.83mv),表明心肌细胞离子通道功能发生紊乱,同时心肌收缩功能明显下降。
2.利用免疫组化和原位杂交技术,观察到RyR2在三组小鼠中的表达有显著性差异(x2=38.04,P<0.01)。进一步两两比较发现,RyR2mRNA在正常小鼠和心肌炎组小鼠中表达明显上调(Z=-4.927,P<0.01),而在心肌炎组小鼠和猝死组小鼠的心肌细胞中表达则没有显著意义(Z=-0.374,P>0.05),可以证实RyR2为心肌炎性猝死发生中一个独立的指标,推测在心肌炎及猝死发生过程中,受病毒和介质的作用,心肌细胞内Ca2+代谢发生紊乱,Ca2+水平下降,作为反馈机制,心脏组织RyR2表达上调,保证心肌功能正常,但由于该通道开放时间过长,并发生过磷酸化,导致心肌内Ca2+水平过度增高,进一步发生突发性的心动过速、室颤等,导致猝死。
3.利用免疫组化和原位杂交技术,对CRT在三组小鼠中的表达进行了检查,结果发现CRT在三组小鼠中的表达有显著性差异(x2=34.846,P<0.01)。两两比较发现,CRT蛋白在正常组小鼠和心肌炎组小鼠中表达明显下降(Z=-3.664,P<0.01),而在心肌炎组小鼠和猝死组小鼠的表达则没有显著意义(Z=-0.581,P>0.05),推测在心肌炎发生过程中,心肌细胞内在病毒及病毒介导的变态反应中,Ca2+呈现一个波动变化,但是总的趋势是由于细胞代谢发生紊乱下降导致Ca2+下降,为了使细胞中Ca2+浓度维持一个稳定水平,作为反馈机制,CRT呈现一个低表达的趋势,使ER中更多的Ca2+释放进入细胞液,这样可以使胞液中的Ca2+保持一个较高水平,维持细胞的收缩功能与代谢功能。
本研究心肌炎猝死动物模型的建立以及部分心电相关蛋白(RyR2、CRT)的一系列检测,得到如下结论:
1.复制了心肌炎小鼠动物模型及心肌炎猝死小鼠动物模型,为下一步的蛋白/基因检验奠定了实验基础。
2.RyR2蛋白在正常小鼠心肌细胞中度表达,在心肌炎或是猝死小鼠心肌细胞中表达上调,有助于判定心肌炎和猝死。
3.CRT蛋白在正常小鼠心肌细胞中高表达,在心肌炎和猝死小鼠心肌细胞中表达下调,为心肌炎及猝死的判断提供了一个参考依据。