免疫治疗是目前肿瘤治疗的焦点,通过调动机体免疫系统识别和杀灭肿瘤细胞。CTL细胞是免疫治疗的中心效应细胞,对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力。基于此,以解除T细胞免疫抑制为机理的免疫检查点阻断疗法近年来被广泛应用于临床抗肿瘤治疗,并取得良好疗效。此外,通过直接编辑T细胞,例如嵌合抗原受体T（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）细胞疗法在多种血液瘤治疗中也显示出很好的肿瘤消除率。尽管基于T细胞的免疫疗法已取得巨大进展,但实体瘤的低反应率和免疫反应不足等问题仍然限制了其临床应用。免疫系统是一个复杂的体系,依赖CTL的抗肿瘤免疫受多种因素影响。首先,产生足量CTL是机体发挥有效抗肿瘤免疫的基础,然而,肿瘤的低免疫原性难以刺激机体产生足量的CTL;其次,活化的CTL到达肿瘤组织后其活性会因代谢改变而受到抑制。此外,肿瘤细胞能通过促进免疫检查点高表达逃避CTL的杀伤作用。因此,基于CTL发挥肿瘤免疫效果的需求,本文提出增加CTL的数量、促进CTL效能和缓解CTL免疫抑制的三重促进策略,为基于CTL的治疗提供新的方案。自体肿瘤疫苗因能诱导机体产生特异性CTL而受到广泛关注。使用切除的肿瘤作为抗原来源,制备疫苗可引发针对自体肿瘤的高特异性抗肿瘤T细胞免疫。但免疫原性弱限制了其免疫效果和临床应用。因此,本文利用切除肿瘤的细胞膜设计了一种高效自体肿瘤疫苗。为提高自体肿瘤疫苗的抗肿瘤效应,采用佐剂联合策略。在不同的佐剂相关通路中,STING是一种细胞内模式识别受体,激活DC中的cGAS-STING通路可启动Ⅰ型IFN反应,促进DC成熟。激活TLR9通路可诱导IL-6、IL-12和TNF-α等细胞因子分泌,调节机体的免疫反应。将TLR9与STING通路的激动剂CpG和cGAMP相结合,能协同促进IFNⅠ和TNF α等炎性细胞因子的分泌,增强抗原特异性免疫反应。抗原和佐剂的递送情况也影响疫苗免疫应答水平。DOPE在溶酶体内酸性环境中能发生相变促进抗原的溶酶体逃逸,逃逸后的抗原经MHCⅠ途径递呈,可增加CTL的分化。因此,本文在疫苗制备过程中加入DOPE,并用甘露糖修饰以靶向DC共递送肿瘤抗原和佐剂,实现抗原的交叉递呈,有效促进CTL的产生。CTL功能状态是进行有效抗肿瘤免疫的关键决定因素。肿瘤细胞与CTL之间的代谢竞争限制CTL对营养物质的正常代谢,影响CTL的功能。在肿瘤微环境中免疫细胞会进行代谢重编程,利用脂肪酸供应能量,脂肪酸分解代谢可改善CTL功能,促进抗肿瘤免疫治疗。非诺贝特可诱导PPAR-α和下游脂肪酸代谢相关基因的表达,促进脂肪酸代谢,减轻肿瘤细胞代谢物对T细胞的不利影响。因此本文利用非诺贝特来改善CTL的代谢过程,保护CTL的效应功能。肿瘤微环境中的免疫抑制信号可导致肿瘤细胞免疫逃逸,进而影响CTL的杀伤效果。程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein 1,PD-1）是T细胞上的关键免疫检查点受体,在肿瘤组织中,肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞上的PD-1分子结合,传递抑制信号,导致肿瘤细胞免疫逃逸。免疫检查点阻断疗法是缓解T细胞抑制信号的有效手段,阻断PD-1信号传导能有效抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。由于免疫检查点疗法依赖于有效的T细胞活化,因此可与肿瘤疫苗联合使用,协同发挥免疫治疗作用。基于此,本论文设计制备了患者个性化的自体肿瘤疫苗,首先,将手术切除的肿瘤作为抗原来源提取肿瘤细胞膜;其次,利用融合脂质DOPE和DOTAP作为载体材料,DSPE-PEG-Man作为靶标,制备共载CpG和cGAMP脂质体,最后将肿瘤细胞膜与载佐剂脂质体通过挤压融合得到高效自体肿瘤疫苗（C/G-HL-Man）。C/G-HL-Man可有效靶向DC,调节抗原的交叉递呈并促进DC成熟,皮下注射C/G-HL-Man后触发强大的CTL免疫应答,有效抑制复发肿瘤生长。将C/G-HL-Man与降脂药非诺贝特和/或PD-1抗体联合使用,能显著抑制小鼠复发肿瘤生长,延长生存期,展现出良好的临床应用前景。本课题主要研究内容及结果如下:1.cGAMP含量测定方法学的建立使用HPLC法成功建立了 cGAMP体外含量测定方法学。2.C/G-HL-Man的制备及表征为了能实现疫苗的DC靶向,合成了靶标DSPE-PEG2000-Man。通过薄膜水化法制备了载cGAMP的DC靶向性阳离子脂质体,再和CpG孵育通过静电作用得到共载cGAMP和CpG的脂质体。将其与从手术切块中提取的肿瘤细胞膜进行挤压融合得到靶向性自体肿瘤疫苗C/G-HL-Man。对C/G-HL-Man的粒径、形态、电位和蛋白进行评价。结果表明C/G-HL-Man的粒径为167.53±6.9 nm;电位为-8.677±1.21 mV;C/G-HL-Man完整保留了肿瘤细胞膜上的蛋白成分。疫苗体系中的cGAMP在pH 7.4的条件中释放缓慢,在pH 5.0条件下药物释放较快,具有pH敏感性。3.C/G-HL-Man的体外评价从小鼠骨髓中提取细胞并进行诱导考察疫苗体系对于BMDC的影响,在细胞摄取实验中C/G-HL-Man在甘露糖的介导作用下能靶向BMDC,促进BMDC对疫苗的摄取。DOPE促使肿瘤抗原在溶酶体酸性环境中发生明显的溶酶体逃逸行为。在体外刺激实验中,C/G-HL-Man与Membrane及佐剂单载纳米疫苗组C-HL和G-HL相比,显著促进了 DC成熟和细胞因子分泌。淋巴结聚集实验的离体成像结果表明纳米载体递送能增加在淋巴结的聚集,甘露糖修饰进一步促进了纳米载体在淋巴结部位的聚集。这些结果表明,C/G-HL-Man具有明显的DC靶向性,且在溶酶体酸性环境中产生溶酶体逃逸,抗原和佐剂联合能显著促进BMDC的成熟。4.高效自体肿瘤疫苗与脂代谢调节及免疫检查点阻断等免疫疗法联合抑制复发肿瘤的效果评价通过预防性实验和对复发肿瘤的抑制实验考察了疫苗体系和联合治疗方案对肿瘤发生及发展的影响,结果表明C/G-HL-Man治疗能诱导免疫记忆,具有良好的预防肿瘤发生及发展的作用。体内免疫学考察结果表明C/G-HL-Man可促进淋巴结中DC成熟和T细胞瘤内浸润,增加记忆性T细胞和CTL的数量,重塑肿瘤微环境,产生抗肿瘤作用,有效抑制小鼠复发肿瘤的进展,延长生存期。C/G-HL-Man、非诺贝特和PD-1抗体联合用于小鼠术后抗复发治疗,结果表明它们能分别促进CTL产生、改善CTL效能和解除肿瘤微环境的免疫抑制作用,有效抑制复发肿瘤的生长,进一步延长生存期,产生良好的抗肿瘤疗效。综上,本文基于在抗肿瘤过程中促进T细胞免疫效果的理念,建立高效自体肿瘤疫苗、脂代谢调节和免疫检验点阻断疗法联合的三联术后给药方案。三者分别作用于CTL细胞产生、脂代谢改善和解除CTL抑制信号阶段,有效增加CTL的数量与活性,提高肿瘤治疗效果,为肿瘤术后个性化联合治疗提供了有效的思路。