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炎症反应作为宿主防御与系统免疫应答的重要组成部分,在免疫调节与维持组织稳态过程中具有重要作用。巨噬细胞作为主要的免疫细胞,参与炎症与免疫过程中清除病原体及提呈抗原等多个阶段。大米蛋白酶解活性肽具有多种生物活性,目前研究主要集中于其抗氧化及降血压活性,而免疫活性方面的报道较少。本课题前期研究发现大米蛋白的胰酶水解物具有促进巨噬细胞增殖作用,并通过大孔吸附树脂、离子交换色谱与凝胶渗透色谱对混合肽进行分离纯化得到不同的大米肽组分。本研究采用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,以细胞内一氧化氮(Nitric oxide,NO)的产量变化为依据,筛选大米胰酶水解免疫活性肽,并探究了该免疫活性肽在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中分子水平的抗炎机制。论文以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为实验载体,建立LPS刺激的炎症模型,并以细胞NO释放量作为炎症效应指标,筛选出对NO释放抑制效果最佳的大米肽组分。结果表明,RPHs(大米蛋白酶解物,Rice protein hydrolysates)对NO产生的抑制率为27.43%;该混合肽经大孔吸附树脂纯化后,所获得的RPHs-C组分对NO产生的抑制率可达到29.51%。RPHs-C继续经离子交换树脂纯化获得组分RPHs-C-7,该组分对NO产生的抑制率为27.56%。而经凝胶色谱进一步纯化所得的三个组分(RPHs-C-7-1、2和3)均能显著抑制NO产生(P<0.01),并呈现浓度依赖性,其中RPHs-C-7-3对NO产生的抑制率可达61.38%,此组分即为大米免疫活性肽,本文进一步对其进行深入的抗炎机制分析。本论文首先探讨了RPHs-C-7-3对LPS引起的促炎介质表达的影响。经酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及Western blot实验分析发现,不同浓度的RPHs-C-7-3对LPS引起的肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)释放及一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白表达均具有极显著抑制作用(P<0.01),说明大米免疫活性肽可从蛋白水平抑制促炎介质的表达。反转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)分析结果发现,RPHs-C-7-3可抑制iNOS、TNF-α、白细胞介素-6、1β(Interleukin,IL-6、1β)等促炎介质mRNA的表达(P<0.01),并且抑制效果与该免疫活性肽的浓度呈正相关,表明大米免疫活性肽可从mRNA水平抑制上述四种促炎介质的表达。巨噬细胞具有特殊的吞噬功能,在炎症反应中具有吞噬病原体的作用。本研究采用流式细胞术(Flow cytometry)继续探究了LPS诱导的RAW264.7炎症模型中RPHs-C-7-3对巨噬细胞吞噬功能的影响。结果表明,在LPS刺激的炎症模型组中,巨噬细胞的吞噬能力明显增强,细胞吞噬荧光微珠比例从刺激前的14.32%升至56.87%(P<0.01);而62.50、125.00和250.00μg/mL的RPHs-C-7-3可使该吞噬率分别降至36.92%、38.35%、38.90%(P<0.01),表明大米免疫活性肽可极显著抑制LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能。在此基础上,本论文进一步利用Western blot技术考察了NF-κB与MAPK两条炎症通路的激活情况,探讨了RPHs-C-7-3的抗炎作用机制。考察NF-κB通路中p65蛋白的入核情况的实验结果表明,经LPS刺激后,细胞核内p65的量明显增加。然而62.50-250.00μg/mL的RPHs-C-7-3均可极显著抑制p65的入核(P<0.01),抑制程度与RPHs-C-7-3的浓度呈正相关。LPS诱导的MAPK通路中ERK的磷酸化同样受到RPHs-C-7-3的抑制(P<0.01)。以上研究结果表明大米免疫活性肽可抑制LPS诱导的NF-κB与MAPK两条炎症通路的激活。综上所述,以NO的释放作为炎症指标,所筛选出的大米免疫活性肽RPHs-C-7-3可从蛋白及mRNA水平抑制细胞炎症因子的表达,及LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能。RPHs-C-7-3通过阻碍p65入核及ERK的磷酸化,分别影响巨噬细胞的NF-κB及MAPK炎症通路,从而实现抗炎作用进而显示出免疫活性。本研究揭示了大米免疫活性肽的炎症调控机制,为大米免疫活性肽的应用提供理论依据。