机体天然免疫系统(innate immune system)能够识别和清除感染病原体,从而抵抗病原体感染与损伤。天然免疫系统主要由天然免疫细胞以及相关细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),启动细胞内天然免疫信号转导,产生Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)和促炎细胞因子,以抵抗病原体感染。RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)属于PRRs中的一类关键受体,在细胞浆中识别RNA病毒,介导抗病毒天然免疫反应,在机体天然免疫应答中发挥着至关重要的作用。RIG-I作为RLRs中的最关键的受体分子,可以通过识别RNA病毒或病毒复制中产物,通过接头分子MAVS,活化TBK1-IRF3信号,激发IFN-Ⅰ产生,从而抵抗病毒感染。在RIG-I发挥功能的过程中,磷酸化修饰和泛素化修饰以及相关的酶分子发挥了重要的调控作用,影响着RIG-I信号的起始、传递和终止等进程,进而维持着机体的免疫平衡。基于我们前期对RIG-I信号转导通路的研究,我们通过IP-MS技术鉴定与RIG-I相互作用的蛋白质分子及其翻译后修饰类型。通过分析质谱数据,我们发现RIG-I的相互作用分子中包括甲基转移酶、乙酰基转移酶、E3泛素连接酶、激酶/磷酸酶、代谢以及RNA修饰相关分子等,小鼠RIG-I(mRIG-I)的翻译后修饰类型包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化修饰等;其中,许多相互作用分子和翻译后修饰在RIG-I信号转导通路中的功能尚未知。我们对质谱数据进行了验证并克隆了mRIG-I修饰位点的突变载体,开展了相关功能学研究。蛋白精氨酸甲基转移酶是一类在组织细胞中广泛表达的酶分子,其主要包含9个家族分子,介导蛋白精氨酸残基的甲基化修饰,参与调控多种细胞进程,影响肿瘤、炎症、代谢、DNA损伤修复等生命活动过程。随着抗体开发技术和蛋白组学技术的发展,PRMTs和精氨酸甲基化修饰的研究得以广泛开展,但是其在天然免疫,尤其在抗病毒天然免疫中的功能还没有相关报道。在质谱鉴定的RIG-I的相互作用分子中,我们发现多个PRMTs家族的成员,提示PRMTs可能参与调节天然免疫应答。我们克隆了PRMTs的9个分子,利用报告基因实验对PRMTs影响IFN-β表达的功能进行筛查,发现9个PRMTs分子都能调控IFN-β的表达,而PRMT6是其中抑制IFN-β表达效应最显著的分子。我们还通过构建PRMTs稳定过表达的Raw264.7细胞株,用VSV病毒感染,发现PRMT6稳定过表达可以显著抑制病毒感染诱导的IFN-Ⅰ和IL-6的产生,相应的IRF3活化也显著低于对照。此外,在Raw264.7细胞、NIH3T3细胞和A549细胞中瞬时过表达PRMT6分子,再用病毒刺激,也获得类似的结果。以上结果证实了PRMT6可以负向调节抗病毒天然免疫反应。为了检测PRMT6的体内效应,我们构建了Prmt6基因敲除小鼠。首先,我们发现Prmt6缺失并不影响小鼠的正常生长发育和免疫系统的发育。通过VSV病毒感染同窝小鼠,我们发现,Prmt6缺失可以显著提高小鼠的生存率。进一步用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中细胞因子水平,发现Prmt6缺失小鼠血清中的IFN-α、IFN-β和IL-6显著高于对照小鼠,相对应的,Prmt6缺失小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中VSV病毒的复制显著低于对照。组织学检测肺部炎性细胞浸润情况也显示Prmt6缺失小鼠的肺部炎性细胞浸润明显低于对照小鼠。这些结果表明了Prmt6缺失可以显著增强小鼠抵抗病毒感染的能力,证实了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能。我们进一步用RNA和DNA病毒分别刺激Prmt6缺失的BMDM细胞,发现VSV病毒和HSV-1病毒刺激均能够诱导Prmt6缺失的BMDM细胞产生更多的IFN-α、IFN-β和IL-6,这与体内实验结果是一致的。我们进一步分析了信号转导通路变化情况,发现Prmt6缺失可以显著增强病毒诱导的IRF3的活化,而不影响TBK1的磷酸化以及NF-κB和MAPK信号。这些结果说明了PRMT6通过抑制IRF3活化来抑制IFN-Ⅰ产生,从而抑制抗病毒天然免疫反应。体内体外的结果明确了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能,病毒感染是否会引起PRMT6表达水平和细胞定位的改变呢?我们利用Western Blot分析了病毒感染细胞的蛋白变化,发现病毒感染可以显著上调小鼠和人巨噬细胞中PRMT6的蛋白水平,同样,病毒感染也可以引起人肿瘤细胞A549和HepG2中PRMT6的蛋白增加。与此同时,GDS5093、GDS1667和GDS2164中的公共数据也提示病毒感染可以上调PRMT6的表达,而且这种变化可能与病程密切相关。我们利用Western Blot检测了巨噬细胞中PRMT6的胞浆胞核分布情况,发现PRMT6主要分布在细胞浆中,只有很少量的PRMT6分布于细胞核中,而且PRMT6的分布不随病毒感染而改变。这些结果与PRMT6通过调控IRF3磷酸化水平抑制IFN-Ⅰ产生的效应相吻合。PRMTs功能的发挥大多依赖其甲基转移酶活性,PRMT6抑制抗病毒天然免疫反应是否依赖其甲基转移酶活性呢?我们根据已有的文献信息,构建了PRMT6的酶活性突变体PRMT6(dead)。通过报告基因实验,我们发现PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、RIG-I-2CARD、MAVS、TBK1、IRF3-5D等诱导的IFN-β的表达,而PRMT6(dead)并不能有效地逆转PRMT6的抑制效应。这些结果证实了PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,表现出与常规PRMTs不一样的功能特征。接头分子TRIF、STING、MAVS均可以通过TBK1-IRF3信号激活IFN-Ⅰ的产生,而我们的报告基因结果也证实了PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、MAVS诱导的IFN-β的产生,这说明了PRMT6可能靶向TBK1-IRF3信号。进一步的报告基因实验结果也证实了PRMT6确实可以通过靶向TBK1-IRF3复合体来抑制IRF3活化,从而抑制IFN-β表达。结合前面Prmt6缺失可以增强IRF3磷酸化,但并不影响TBK1活化的结果,我们进一步检测PRMT6是否影响TBK1的激酶活性。通过体外激酶实验,我们发现PRMT6并不影响TBK1的激酶活性。以上结果证实了PRMT6靶向TBK1-IRF3复合体进而抑制IRF3的活化,这一过程不依赖其甲基转移酶活性,也不影响TBK1的激酶活性。既然PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,也不影响TBK1活化和TBK1的激酶活性,那么,PRMT6是否可以直接结合TBK1或者IRF3,从而抑制信号的传递呢?通过免疫共沉淀实验,我们发现PRMT6可以直接结合IRF3,而不结合TBK1、IKKε和IRF7。通过检测内源性的蛋白结合情况,发现在静息的小鼠和人的巨噬细胞中,PRMT6可以结合IRF3,而当病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强。在Prmt6缺失的BMDM细胞中,发现Prmt6缺失可以显著促进病毒诱导的TBK1与IRF3的结合,从而增强IRF3的活化。利用HEK293T细胞过表达实验也证实了PRMT6可以结合IRF3,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3磷酸化。研究结果表明,PRMT6可以结合IRF3,而且,在病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF 3的活化,使IFN-Ⅰ产生减少,抑制机体抗病毒天然免疫反应。我们进一步根据PRMT6的结构域特征构建了PRMT6的截短体表达载体,通过免疫共沉淀实验,发现PRMT6与IRF3的结合主要依赖其N端结构域,而PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能则主要依赖其AA189-318结构域。这些结果也提示了PRMT6发挥功能可能依赖其N端结构域结合IRF3,进而通过空间位阻效应阻碍TBK1与IRF3的结合,从而抑制IRF3活化和抗病毒天然免疫反应。综上,在本研究中,我们鉴定了RIG-I的相互作用分子和翻译后修饰类型,揭示了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的效应与机制,将PRMTs与天然免疫联系起来,为PRMTs的生物学研究提供了新的视角,也为病毒感染的干预和治疗提供了潜在靶点和理论依据。同时,我们的研究所揭示的具体机制也可能是病毒逃逸免疫系统攻击的一种策略,在一定程度上增加了我们对病毒逃逸机制的认识。