【摘 要】
:
目的:研发一种基于滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的前列腺特异性抗原(PSA)比色检测新方法。方法:利用PSA类似于胰蛋白酶特异性剪切多肽活性,设计PSA剪切底物共价连接RCA启动链与纳米磁珠,PSA靶向剪切多肽后,通过磁性分离RCA启动链,进而触发RCA反应产生大量G4 DNA链,与氯化血红素(Hemin)结
【基金项目】
:
国家自然科学基金(No. 82160409); 贵州省科技计划项目(黔科合基础[2018]1196); 重庆市自然科学基金(cstc2018jcyj AX0201);
论文部分内容阅读
目的:研发一种基于滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的前列腺特异性抗原(PSA)比色检测新方法。方法:利用PSA类似于胰蛋白酶特异性剪切多肽活性,设计PSA剪切底物共价连接RCA启动链与纳米磁珠,PSA靶向剪切多肽后,通过磁性分离RCA启动链,进而触发RCA反应产生大量G4 DNA链,与氯化血红素(Hemin)结合后形成DNA模拟酶催化TMB显色反应,最终构建一种新型PSA检测新方法。本研究通过电泳、分光光度法等方式表征设计原理中的关键环节,并利于全波长紫外-可见分光光度计进行整体可行性分析;对RCA反应关键酶浓度、G4-Hemin DNA模拟酶催化反应的缓冲液成分、温度与比色检测条件等多方面进行优化,并在最佳实验条件下进行特异性、重复性、线下范围与检测限、以及回收率等多项方法学指标评价,最终收集9例临床样本进行临床实际样本检测。结果:本研究成功构建出一种检测PSA的比色检测新策略,并基于该策略提出高特异、简便快捷的PSA检测新方法,设计原理图中的关键步骤均被电泳、分光光度法等成功表征,并且整体方案的可行性分析验证了其比色检测的能力。实验优化结果:最佳RCA反应条件为:0.4 U/μL的Phi29酶以及0.3 U/μL的Nb.Bbv CI切口酶,在1.5×的r Custmart buffer中进行反应;G4 DNA与Hemin最佳孵育缓冲液中K+浓度为100 mmol/L,最适p H为7.5,温度为37℃,而G4-Hemin DNA模拟酶的最佳催化TMB反应温度也为37℃。新方法的方法学评价显示:该方法具有良好的检测特异性与稳定性,线性范围为1-100 ng/m L,最低检测限为0.732 ng/m L,并且在20%血清复杂基质中不同浓度的回收率达到94.2%——表明抗干扰能力强;抗干扰能力强。本研究新方法进行6例异常PSA血清样本检测与3例正常体检患者血清样本检测的结果经过数据拟合后与临床现行f PSA的检测结果基本一致进行本方法的检测结果相比一致,表明新方法具有临床实际样本检测能力。结论:本研究成功发展出一种基于RCA与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的新型PSA比色检测方法,具有良好的特异性、灵敏度与抗干扰性,并实现了前列腺癌患者实际样本检测,为PSA的临床检测提供了一种全新的思路,在前列腺癌的早期诊断、与术后监测等方面具有重要的潜在应用价值。
其他文献
目的:颈动脉粥样硬化(Carotid Atherosclerosis,CA)是脑梗死(Cerebral Infarction,CI)发生及发展的重要原因,其严重程度与脑梗死发生风险相关。同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)是CA的重要影响因素,在体内主要通过亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate Reductase,MTHFR)代谢。MTHFR基因多态
目的:探究脂肪干细胞胶条件培养基(Stromal vascular fraction-gel-conditioned medium,SVF-gel-CM)促进糖尿病鼠创面愈合的机制,并阐明成脂信号对糖尿病创面愈合的影响,为SVF-gel-CM的临床应用提供理论基础。方法:1、探讨SVF-gel-CM促进糖尿病鼠创面愈合的机制:体外获取SVF-gel-CM,构建糖尿病小鼠皮肤创面模型,然后将SVF-
目的:研究脐带延迟结扎(Delayed Cord Clamping,DCC)与脐带立即结扎(Immediate Cord Clamping,ICC)对早产儿脑血流动力学影响。方法:该试验是一项前瞻性、无创性研究。将满足纳入排除标准的早产儿按照其在产科完成的结扎脐带方式分为DCC组与ICC组,在生后1h内、24±1h、48±1h、72±1h时采用Mindray M9型彩色超声诊断仪分别测量大脑中动脉
目的:探究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)来源的雪旺氏细胞样细胞(Schwann cell-like cells,SCLCs)外泌体对周围神经损伤的修复作用,以及其促进周围神经修复再生的机制。方法:(1)从人羊膜组织中提取h AMSCs,培养至P3代,通过细胞形态观察、细胞免疫荧光、流式细胞术进行鉴定,并通过三系诱导实
目的:探索在Transwell共培养条件下,人子宫内膜间质细胞对种植在人脱细胞羊膜上的人羊膜间充质干细胞的定向诱导作用。方法:人羊膜组织分离获取人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs),行流式细胞学表型及免疫荧光对h AMSCs进行鉴定。酶脱细胞方法制备人脱细胞羊膜(Human acellular amniotic membr
目的:基于结构磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)评估脑瘫(cerebral palsy,CP)儿童手节形态及其结构指标与手功能的关系。方法:1.对2019年5月至2021年9月收集的70例经临床确诊为CP的儿童,行三维T1加权成像(three-dimensional T1-weighted image,3D-T1WI)、手功能分级系统(manual abil
目的:(1)利用正交实验设计法对超声声强、微泡/细胞悬液体积比、占空比、辐照时间进行参数优化,确定不同超声参数对膀胱癌T24细胞膜通透性的影响,为超声联合微泡基因传染膀胱癌细胞奠定实验基础。(2)采用超声联合微泡介导p EGFP-N1-wt-p53基因转染膀胱癌T24细胞,探讨其转染效率及细胞凋亡情况。方法:(1)设定超声声强、微泡/细胞悬液体积比、占空比、辐照时间为正交试验设计的4个因素,每个因
目的:通过对酸碱修饰的橘皮果胶(p H-modified Citrus Pectin,MCP)进行分离纯化与基本结构分析,分析MCP中抑制galectin-8的主要活性成分,探讨MCP中活性组分与galectin-8相互作用的初步构效关系。方法:采用酸碱修饰的方法制得MCP,经体积分数为30%、50%、70%的乙醇逐步醇沉的方法对MCP进行初步分级后,得到三个组分,即MCP-30、MCP-50、M
目的:本研究观察DLX1基因rs788172和rs788173位点以及DLX2基因rs743605和rs3762499位点的单核苷酸多态性在贵州省燃煤污染型氟斑牙患者与健康人群中的分布规律,通过分析DLX1和DLX2基因多态性,探讨氟斑牙与遗传易感性或耐受性的关系。方法:采用病例对照研究,在贵州省毕节市纳入117名氟斑牙患者作为病例组,109名非氟斑牙受试者作为对照组,各组受试者年龄区间为18~8