【摘 要】
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目的:研发一种基于滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的前列腺特异性抗原（PSA）比色检测新方法。方法:利用PSA类似于胰蛋白酶特异性剪切多肽活性,设计PSA剪切底物共价连接RCA启动链与纳米磁珠,PSA靶向剪切多肽后,通过磁性分离RCA启动链,进而触发RCA反应产生大量G4 DNA链,与氯化血红素（Hemin）结
【基金项目】
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国家自然科学基金（No. 82160409）； 贵州省科技计划项目（黔科合基础[2018]1196）； 重庆市自然科学基金（cstc2018jcyj AX0201）；
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目的:研发一种基于滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的前列腺特异性抗原（PSA）比色检测新方法。方法:利用PSA类似于胰蛋白酶特异性剪切多肽活性,设计PSA剪切底物共价连接RCA启动链与纳米磁珠,PSA靶向剪切多肽后,通过磁性分离RCA启动链,进而触发RCA反应产生大量G4 DNA链,与氯化血红素（Hemin）结合后形成DNA模拟酶催化TMB显色反应,最终构建一种新型PSA检测新方法。本研究通过电泳、分光光度法等方式表征设计原理中的关键环节,并利于全波长紫外-可见分光光度计进行整体可行性分析;对RCA反应关键酶浓度、G4-Hemin DNA模拟酶催化反应的缓冲液成分、温度与比色检测条件等多方面进行优化,并在最佳实验条件下进行特异性、重复性、线下范围与检测限、以及回收率等多项方法学指标评价,最终收集9例临床样本进行临床实际样本检测。结果:本研究成功构建出一种检测PSA的比色检测新策略,并基于该策略提出高特异、简便快捷的PSA检测新方法,设计原理图中的关键步骤均被电泳、分光光度法等成功表征,并且整体方案的可行性分析验证了其比色检测的能力。实验优化结果:最佳RCA反应条件为:0.4 U/μL的Phi29酶以及0.3 U/μL的Nb.Bbv CI切口酶,在1.5×的r Custmart buffer中进行反应;G4 DNA与Hemin最佳孵育缓冲液中K+浓度为100 mmol/L,最适p H为7.5,温度为37℃,而G4-Hemin DNA模拟酶的最佳催化TMB反应温度也为37℃。新方法的方法学评价显示:该方法具有良好的检测特异性与稳定性,线性范围为1-100 ng/m L,最低检测限为0.732 ng/m L,并且在20%血清复杂基质中不同浓度的回收率达到94.2%——表明抗干扰能力强;抗干扰能力强。本研究新方法进行6例异常PSA血清样本检测与3例正常体检患者血清样本检测的结果经过数据拟合后与临床现行f PSA的检测结果基本一致进行本方法的检测结果相比一致,表明新方法具有临床实际样本检测能力。结论:本研究成功发展出一种基于RCA与G4-Hemin DNA模拟酶催化放大策略的新型PSA比色检测方法,具有良好的特异性、灵敏度与抗干扰性,并实现了前列腺癌患者实际样本检测,为PSA的临床检测提供了一种全新的思路,在前列腺癌的早期诊断、与术后监测等方面具有重要的潜在应用价值。
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