丝状真菌黑曲霉遗传背景清晰,安全系数高,具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能,是理想的真核分泌蛋白表达系统。但利用其表达外源蛋白时,外源蛋白时,产量较低,种类较少,蛋白表达的普适性较差。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前被应用最广泛的外源基因的表达系统之一,统计已有超过5000种外源蛋白利用其表达并进行工业化生产。毕赤酵母高效分泌的原因之一是α-因子信号肽的前导肽,这对于蛋白质的分泌有着至关重要的作用。研究表明,ER衍生的囊泡蛋白29（ER-derived vesicular protein 29,Erv29p）是一种受体,能够特异性结合α-因子等可溶性分泌蛋白的氨基末端APV、IPV等三肽,使它们能够优先离开内质网,从而减少了这些蛋白质在内质网中的聚集,提高了其分泌表达量。过量位点蛋白（Surf4）是Erv29p的人类同源物,Erv29p可以挽救Surf4缺失的人类细胞中的有效内质网运输。通过对黑曲霉基因组序列与Surf4/Erv29p基因序列的比对,发现黑曲霉基因组中也有类似的Erv29基因,说明在黑曲霉中也可能存在着受体Erv29p介导的将分泌蛋白转运出内质网这一保守的转运通路。基于此,本实验选择无孢黑曲霉TH-2作为受体菌株,以脯氨酰内肽酶和酸性蛋白酶为目标分泌蛋白,使用Pgla A6R强启动子和高效分泌信号肽Sgla A调控目的基因表达,通过在目标分泌蛋白的N末端添加可被Erv29p识别的APV三肽或α-因子前导肽,探究添加不同的N末端短肽对分泌蛋白表达的影响,为黑曲霉高效分泌表达重组蛋白探索新的技术方案。取得的主要研究结果如下:（1）表达载体的构建首先构建了pSZHG6R-APV和pSZHG6R-pro-αF两种通用表达载体。然后将prot A基因、pep B基因连接到上述两种通用表达载体和pSZHG6R上,构建了6个表达载体:pSZHG6Rprot A、pSZHG6R-APV-prot A、pSZHG6R-pro-αF-prot A、pSZHG6R-pep B、pSZHG6R-APV-pep B、pSZHG6R-pro-αF-pep B。（2）黑曲霉重组菌株的构建用冻融法将构建好的表达载体转入农杆菌AGL1中,采用农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2。提取菌丝基因组进行PCR酶切鉴定,获得6株纯合重组菌株。（3）重组菌株分泌蛋白的检测、酶活测定及结果分析脯氨酰内肽酶N末端添加APV三肽和α-因子前导肽后,酶活力分别是未修饰的1.45和1.16倍,最高可达0.452 U/m L。酸性蛋白酶N末端修饰α-因子前导肽后,酶活力最高可达1380 U/m L,是未修饰的1.13倍。N末端修饰APV后,酶活力降低,仅为未修饰的19%。N末端修饰α-因子前导肽效果较为稳定,酶活力约增长10%。