PCR检测鸭瘟病毒方法的建立及鸭瘟病毒强毒SC1株在急性人工感染成年鸭体内分布规律的研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:feng_lingpeng
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根据基因库(GenBank)登载的鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)基因组的一段765bp长的保守基因序列EcoR Ⅰ片段,运用OLIGO6.0软件设计了一对引物,其扩增幅度为498bp。用这对引物对DPV进行扩增,获得了与设计大小相符合的特异条带,成功建立了检测DPV的PCR方法,并确立了PCR的最佳反应条件,引物浓度为0.5μM,Mg2+作用浓度为2.5μM;最佳反应模式为95℃变性5min,进入94℃ 1min,51.8℃ 1min,72℃ 2min的循环,共进行35个循环,最后经72℃延伸10min后于4℃结束反应。对DPV DNA能扩增出特异条带,为阳性;而对其它6种禽病病原体(MDV、ILTV、DHV、PM、E.coli、Sal.a)扩增不出任何条带,为阴性。敏感性试验表明可检测到10fg的DPV DNA模板。 本研究还对56只3月龄四川麻鸭经皮下接种DPV强毒SC1株成功建立了DPV感染的急性病理模型,观察了急性病例的临床症状及肉眼病理变化。实验鸭接毒后2h,4h,6h,12h,24h,以后每隔24h进行扑杀,采集组织材料(2只/次),直至有鸭发生死亡为止时停止扑杀转而采集死亡鸭组织材料。采样部位包括血、皮肤、口腔分泌物、心、肝、脾、肺、肾、脑组织、胸肌、食道、十二指肠、直肠、法氏囊、腺胃、粪便、舌头、胸腺、胰腺、大腿骨。应用建立的PCR方法检测不同时间DPV在感染鸭体各组织器官的分布。结果表明,接种2小时后即能够从脑、肝、脾、法氏囊、胸腺中检出DPV DNA;4小时后,能从心、肝、脾、法氏囊、胸腺、胰、脑、血、粪便中检出DPV DNA;6小时后,能从心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰、脑、食道、腺胃、血、舌、口腔、骨髓、粪便中检出DPV DNA;12小时后及其死亡鸭可从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑组织、胸肌、食道、腺胃、血液、舌头、口腔分泌物、皮肤、骨髓和粪便等20种组织器官中检测到DPV的DNA。检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏和脑组织。 由本研究建立的PCR方法可从感染鸭组织器官中特异地检出DPV DNA,可用于DPV感染的早期诊断。DPV在人工感染鸭体内的分布规律为阐明DPV的致病机理提供了有意义的实验数据。
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