骨骼肌形成在多种生物生命的多个阶段中发生,包括胚胎发育以及成年动物骨骼肌损伤后修复。骨骼肌形成的关键事件是成肌细胞相互融合生成新的多核肌纤维,或与现有肌纤维融合从而使肌核的数量进一步增加肌肉生长。细胞融合是一个复杂的过程,需要进行细胞识别、粘附、细胞信号传导、细胞骨架改变和膜重排。成肌细胞融合是细胞融合的一个特殊类型。通过对果蝇胚胎的研究,发现创始细胞(FC)的跨膜蛋白Rst/Kirre和有融合能力的成肌细胞(FCMs)的跨膜蛋白Sns促进两种细胞相互融合。其中Rst/Kirre和Sns的脊椎动物同源物分别是Kirrel和Nephrin。前期研究证明Nephrin在小鼠骨骼肌成肌细胞融合过程起关键作用。Kirrel基因家族包括Kirrel1、Kirrel2和Kirrel3。前期实验发现Kirrel A(Kirrel1的亚型)在成肌细胞融合过程中起作用。而Kirrel2的相关研究主要集中于肾脏和脑,在骨骼肌中未见报道。因此本文将探究Kirrel2对小鼠骨骼肌成肌细胞分化及融合的影响。并在前期实验基础上,进一步研究敲低Kirrel A抑制成肌细胞融合的机制。研究目的1.Kirrel2在小鼠骨骼肌成肌细胞分化及融合过程中的作用。2.敲低Kirrel A抑制成肌细胞融合的机制。研究方法1.半定量RT-PCR以及实时荧光定量RT-q PCR检测Kirrel2在小鼠骨骼肌成肌细胞分化及融合和骨骼肌损伤后修复过程中的表达。2.构建Kirrel2过表达质粒,在小鼠成肌细胞系C2C12内过表达Kirrel2,和对照组观察比对肌管形态和大小并计算融合指数,免疫荧光检测有关功能基因的表达水平。3.利用已有的Kirrel A-、Control-shRNA细胞系,观察比对肌管形态和大小并计算融合指数,Western Blot和免疫荧光检测有关功能基因的表达水平。4.MTT和流式细胞术检测Kirrel A-、Control-sh RNA细胞系的增殖情况。5.细胞划痕实验检测Kirrel A-、Control-sh RNA细胞系的迁移情况。结果1.半定量RT-PCR以及实时荧光定量RT-q PCR结果显示Kirrel2在小鼠骨骼肌成肌细胞分化及融合和骨骼肌损伤后修复过程中m RNA表达量先上升后降低。2.过表达Kirrel2的C2C12成肌细胞与对照组相比,早晚期融合指数没有显著性差异,且肌管大小形态相似。3.在C2C12分化第二天和第五天,Kirrel A-sh RNA细胞系的融合指数均低于Control-sh RNA细胞系。且Western Blot结果显示Kirrel A-sh RNA细胞系的myosin蛋白表达量在分化的D1~D5均低于Control-sh RNA,myogenin表达量则没有明显区别。4.MTT和流式细胞术结果均显示Kirrel A-sh RNA C2C12增殖速度显著低于Control-shRNA C2C12。5.Kirrel A-shRNA和Control-shRNA C2C12 24 h迁移率没有显著差别。结论1.Kirrel2在成肌细胞分化融合和损伤后重建过程中有少量表达,且表达量上升。2.过表达Kirrel2对C2C12分化及融合没有影响。3.敲低Kirrel A抑制C2C12增殖和融合。4.敲低Kirrel A对C2C12分化融合过程的细胞迁移没有影响。