产酸克雷伯氏菌利用稀酸和离子液体预处理后的木质纤维素转化2,3-丁二醇的研究

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随着化石燃料的短缺和环境压力的增长,通过生物方法生产化学产品倍受关注。2,3-丁二醇在能源、食品及化工等领域具有广泛的应用。以木质纤维素为原料,采用微生物发酵法生产2,3-丁二醇成为国内外研究的重点,它不以粮食为原料可以降低2,3-丁二醇的生产成本,提高经济性和保证国家粮食安全。本论文研究高效利用木质纤维素(如小桐子果壳和甘蔗渣)生产2,3-丁二醇,主要内容和研究结果如下:  (1)采用响应面法对产酸克雷伯氏菌发酵葡萄糖生产2,3-丁二醇的培养基进行优化。设计Plackett-Burman实验分析相关因素,发现尿素和乙酸对2,3-丁二醇得率影响显著。采用最陡爬坡实验和中心复合实验进一步优化这两个因素。在最佳条件下,2,3-丁二醇得率达0.456 g/g葡萄糖,与初始条件相比提高了23.2%,达到理论产率的91.2%。本实验采用尿素为唯一氮源,并获得了较高的2,3-丁二醇得率。  (2)首次采用两步法稀酸水解小桐子果壳,以水解液为底物,通过产酸克雷伯氏菌发酵制备2,3-丁二醇。采用单因素实验考察反应时间、反应温度以及酸浓度对水解液中还原糖浓度的影响。第一步稀酸水解反应,采用硫酸浓度1.5 wt%,150℃反应0.5h,得到最高的水解液还原糖含量(34.01 g/L),水溶性产物得率为37.0%。成分分析表明,半纤维素在反应中基本水解完全,残渣中的半纤维素含量只有0.52%,而纤维素含量则高达69.09%。于是,在更苛刻的条件下进行第二步稀酸水解,采用硫酸浓度4wt%,150℃反应1h,得到最高的水解液葡萄糖含量(31.00 g/L)。两步反应总的水溶性产物得率达到了64%,远高于第一步37%的水溶性产物得率。将水解液收集起来经脱毒和浓缩后,用于产酸克雷伯氏菌摇瓶发酵生产2,3-丁二醇。经过60 h的发酵,第一步酸水解液得到21.13 g/L2,3-丁二醇和4.78 g/L3-羟基-2-丁酮,第二步酸水解液得到27.10 g/L2,3-丁二醇和4.48 g/L3-羟基-2-丁酮。采用两步法水解,可以避免苛刻反应条件下的半纤维素损失和温和条件下纤维素水解的不完全,充分有效地利用纤维素和半纤维素,获得较高的目标产物得率。  (3)为了充分利用原料和获得高浓度糖的水解液,微晶纤维素和小桐子果壳在经过离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐(1-butyl-3-methylimidazoliumachloride,[BMIM]Cl)处理后再进行稀酸水解。相比于没有经过预处理的微晶纤维素,离子液体处理后的纤维素在水解后,还原糖的得率和浓度均提高了139%,水溶性产物的得率提高了128%。相比于只经过热水预处理的小桐子果壳,离子液体处理后的小桐子果壳在水解后,还原糖得率提高了80%,还原糖浓度提高了76%,水溶性产物得率提高了70%。此外,离子液体处理还能促进后期的发酵。经过热水处理的小桐子果壳的稀酸水解液的发酵效率为0.35 g/(L·h),而离子液体处理的小桐子果壳的稀酸水解液的发酵效率为0.40 g/(L·h)。  (4)半纤维素的损失以及不能有效地破坏纤维素的结晶结构,是木质纤维素水解液中糖得率低以及水解成本高的主要原因。稀酸水解可以有效地将半纤维素水解成糖,而这些糖可以有效地被细菌利用生成2,3-丁二醇(36.1%)。离子液体处理可以有效地破坏纤维素的结晶结构,从而促进后期的酶解。经过稀酸和离子液体联合预处理后,甘蔗渣中纤维素的水解率(95.5%)明显高于只经过稀酸或离子液体处理的材料。这种策略可以高效地从半纤维素和纤维素中获得糖。相比于传统的预处理方法,这种策略具有以下优势:可以高效地从半纤维素中得到糖;半纤维素水解液可以有效地用于微生物发酵,不仅可以高效地利用原料,还可以降低2,3-丁二醇的生产成本;半纤维素的脱除,不仅可以降低离子液体处理的成本,还可以促进后期纤维素的水解,残余纤维素几乎完全转化为糖;酶水解后的残渣中富含木质素,为木质素的研究提洪了一个新的角度。  本论文通过稀酸和酶水解成功地将木质纤维素转化为糖,进而发酵生产2,3-丁二醇。通过稀酸水解和离子液体预处理的结合,有效地破坏了木质纤维素顽抗结构。半纤维素和纤维素组分同时得到了充分的转化和利用,水解和发酵的效率显著提高。单一的预处理方法不能获得高的水解率,所以需要联合多种预处理的方法,较大幅度地提高反应的效率和过程经济性。本论文的研究对于木质纤维素的预处理、稀酸和酶水解以及利用水解液发酵生产2,3-丁二醇的研究具有重要的指导借鉴意义。
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