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[目的]: 铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为石斛属名贵中药材。其种子自然条件下难以萌发,药材野生资源匮乏,市场上流通的几乎都是人工栽培品。目前,由于在人工种植过程中常出现多种表型性状差异的栽培类型(以下简称类型),这些类型引起药材质量上参差不齐。目前有关铁皮石斛不同栽培类型品质的研究还比较少,本研究旨在采用高效液相色谱法、红外光谱法对铁皮石斛不同栽培类型进行指纹图谱的研究,同时测定其所含的水分、总灰分、纤维素含量、多糖含量、总生物碱含量以及芦丁含量,评价不同类型质量的差异,并对优质铁皮石斛类型进行体外抗氧化和抗肿瘤活性的初步研究,为铁皮石斛种植生产以及质量评价提供科学的参考依据。 [方法与内容]: 1.铁皮石斛主要栽培类型 采集浙江乐清产铁皮石斛,采用游标卡尺和直尺分别测量株高、茎上至下第3节中部直径、另测由上至下第4片叶的叶片长和宽(其相对长宽比以长度和宽度之比表示)等形态指标、并对组成茎的节数做统计。采用Duncans multiple-rangetest检验法对各指标进行多重比较,并采用Origin软件进行作图分析,对农艺性状差异明显的铁皮石斛栽培类型进行研究。 2.铁皮石斛水分、总灰分测定以及纤维素含量的测定 照2010版《中国药典》附录ⅨH方法对不同栽培类型铁皮石斛中的水分进行了检测;以2010版《中国药典》附录ⅨK法为参照测定总灰分的含量;参考相关文献,测定其纤维素含量。 3.铁皮石斛中多糖、总生物和芦丁的含量测定 采用紫外分光光度法测定铁皮石斛中多糖和总生物碱的含量,采用高效液相色谱法测定铁皮石斛以及叶片中芦丁的含量,比较不同栽培类型铁皮石斛有效成分的差异。 4.铁皮石斛高效液相指纹图谱的研究 本文对铁皮石斛药材进行了指纹图谱研究,建立了铁皮石斛药材的高效液相指纹图谱。 5.铁皮石斛红外指纹图谱的研究 采用傅里叶红外光谱仪对不同栽培类型的铁皮石斛及石斛属其他石斛进行了研究,比较其差异性。 6.铁皮石斛体外抗氧化和抗肿瘤活性的研究 采用Folin—Ciocaheu法、Larruri法、改动的Smirnoff水杨酸法分别测定优质栽培类型铁皮石斛的总还原力、清除DPPH的能力、清除羟基自由基的能力,采用MTT法对铁皮石斛进行抗肿瘤活性研究。 [结果]: 1.铁皮石斛主要栽培类型 经表观描述和统计数据分析发现:类型1(Y1)植株较矮、茎绿色(有少量紫色斑点)、茎上下部粗细较一致、叶片较窄;类型2(Y2)植株较矮、茎紫色(有大量紫色斑点)、茎上下部粗细较一致、叶片较窄;类型3(Y3)植株较高、茎绿色(有少量紫色斑点)、茎上下部粗细较一致、叶片较宽;类型(Y4)植株较高、茎紫色(有大量紫色斑点)、茎上部粗下部细、叶片较宽;类型5(Y5)植株较高、茎绿色(有少量紫色斑点)、茎上部粗下部细、叶片较窄。各栽培类型之间均有不同程度的显著性差异。 2.铁皮石斛水分、总灰分测定以及纤维素含量的涓定 5种栽培类型铁皮石斛中的水分、总灰分测定结果表明:水分含量在8.5%-10.6%之间,总灰分在2.2%-3.3%之间,两指标均符合药典铁皮石斛项下的规定要求。纤维素含量则在11.8%-20.9%之间。 3.铁皮石斛多糖、总生物碱和芦丁的含量测定 铁皮石斛中多糖和总生物碱的含量测定结果表明:多糖含量为25.52%-31.36%,是铁皮石斛中的主要成分,其含量达到药典规定要求;总生物碱含量则为0.020%-0.036%之间,含量极低;茎及叶片中芦丁含量分别为:0.068-0.132mg·g-1,0.667-1.373mg·g-1。 4.铁皮石斛高效液相指纹图谱的研究 采用梯度洗脱的方法,以Synergi-C18(250mm×4.60mm,5μm)为分析用色谱柱,以甲醇-0.04%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速0.8mL/min,检测波长280nm,柱温25℃。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会)进行分析。建立了以8个共有峰为特征信息的HPLC指纹图谱,为铁皮石斛质量控制提供了参考依据。 5.铁皮石斛红外指纹图谱的研究 5种栽培类型铁皮石斛的整体红外图谱相近。二阶导数处理后各图谱有明显的差异,具体表现为:在3000-2800 cm-1波数内,Y1、Y2类型与其他类型有明显的差异,尤以Y2最甚;在2500-2300 cm-1波数内,各类型之间均有差别;在1200-650 cm-1波数内,Y1类型与其他类型有明显差异。 石斛属不同品种石斛粉末红外图谱在峰形、峰位上较一致,但铁皮石斛在峰强度上明显强于其他石斛,且铁皮石斛在2126 cm-1有吸收,而其他石斛无;另其他石斛在2852 cm-1处有吸收,而铁皮石斛无。对这10种石斛红外光谱进行二阶导数处理,发现在3000-2800 cm-1波数内,铁皮石斛与其他石斛有明显的差异。在2550-2150cm-1波数内,铁皮石斛、兜唇石斛、米兰石斛、黑毛石斛、齿瓣石斛与其他石斛均有差异,并且相互之间也有差异。 6.铁皮石斛体外抗氧化和抗肿瘤活性的研究 研究表明铁皮石斛优质栽培类型的水提物具有较强的还原性、对DPPH的抑制率高达69.24%、对羟自由基的抑制率最高可达91.14%。体外抗肿瘤结果表明其对正常细胞HL7702生长无抑制,对肿瘤细胞A549、Hela229、HepG2增殖均有一定的抑制作用。 [结论]: 1.铁皮石斛主要栽培类型的研究 在人工种植铁皮石斛的过程中,由于种源产地不同、栽培群体的多轮重组、栽培环境等原因,导致同一产地出现多种栽培类型。 2.铁皮石斛水分、总灰分测定以及纤维素含量的测定 各栽培类型铁皮石斛中水分、总灰分含量均符合药典要求,纤维素含量具有显著性差异。 3.铁皮石斛多糖、总生物碱和芦丁的含量测定 铁皮石斛有效成分主要为多糖、生物碱、黄酮类等成分,多糖是铁皮石斛中主要成分,而总生物碱由于含量极低,黄酮类成分芦丁在铁皮石斛以及其叶片中均有分布且叶片中含量较高。本文建立的对多糖、总生物碱以及芦丁含量的测定方法,具有准确性高、稳定性好、重复性佳等优点,可为铁皮石斛质量评价及资源扩大利用提供科学的指导。 4.铁皮石斛高效液相指纹图谱的研究 采用高效液相色谱法建立以8个共有峰为特征信息的HPLC指纹图谱,为铁皮石斛鉴别提供了一定的参考依据。 5.铁皮石斛红外指纹图谱的研究 采用红外光谱技术,建立起简单、快速、且不破坏药材的铁皮石斛鉴别方法。 6.铁皮石斛体外抗氧化和抗肿瘤活性的研究 体外抗氧化、抗肿瘤研究表明铁皮石斛可作为一种潜在抗氧化剂和防癌剂,用于清除体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老和辅助治疗肺癌、宫颈癌及肝癌。