福氏志贺氏菌（S. flexneri）是发展中国家细菌性痢疾的最主要病原菌，在它的15个亚型里，2a亚型引发感染所占比例最大，2a亚型中的301株为志贺氏菌中第一个完成全基因组测序及注释的菌株。但基因只是遗传信息的载体，并不能从基因序列上直接探究志贺氏菌的致病机制。基因在一定环境条件下，尤其是病原菌在与宿主相互作用过程中表现出侵袭性、致病性时的表达谱，则是我们研究志贺氏菌致病机理的出发点。近年来，国内外对志贺氏菌致病机制的研究从未间断过。一方面，其毒力大质粒编码的III型分泌系统（T3SS）及经其分泌的效应蛋白作为志贺氏菌毒力的主要因素，一直是国内外志贺氏菌研究的热点；另一方面，在志贺氏菌的动物宿主模型研究上，也有报道分别利用仔猪、猕猴、家兔、豚鼠、小鼠等进行过志贺氏菌的研究，但大多只是考察到动物的患病表型，如体重减轻、炎症反应以及肠道黏膜的病理改变等，而鲜有涉及病原菌在适应并侵袭宿主过程中自身的表达改变，尤其是跟致病密切相关的重要毒力因子的表达变化。因而本课题对志贺氏菌的毒力研究将从体外条件下诱导T3SS效应蛋白的分泌鉴定展开，进而利用兔肠结扎模型，对志贺氏菌体内外不同环境下的表达谱进行对比分析，寻找重要的差异表达蛋白，从而研究其与志贺氏菌毒力的关系。　　首先，在体外条件下用化学诱导剂诱导III型分泌系统毒力蛋白的分泌与鉴定实验中，为了获得尽可能多的前期及后期效应分子，我们先进行了301野生株在不同条件下的诱导分泌研究，而后构建了转录调控因子 MxiE及其伴侣分子IpgC的共同过表达株、抗激活因子OspD1的缺失株以及III型分泌系统“开关蛋白”IpaB/IpaD的缺失株，并对这些菌株进行体外条件下诱导分泌分析。结果发现，在 pH4~10的环境中，刚果红（CR）和依文思蓝（EB）均可诱导志贺氏菌分泌效应蛋白，pH低于4时则不能诱导T3SS的开启。对诱导分泌的上清蛋白进行双向电泳（2-DE）和质谱（MALDI-TOF/TOF）分析时，除鉴定到已报道的一些效应蛋白外，在ipaB/ipaD缺失株中还鉴定到IpaH1.4、IpaH_5和IpaH_7等尚未报道的分泌蛋白，它们的结构中均含有一个新的C端E3连接酶，在已知的后期效应分子IpaH9.8中也具有这种结构，说明它们可能为T3SS的后期效应分子。这些新鉴定到的分泌蛋白的功能以及与致病的关系有待进一步探究。　　另一方面，本课题采用兔肠结扎模型开展了志贺氏菌体内外表达谱的对比研究。前期的方案是透析袋结扎模型，将志贺氏菌用PBS悬起来后装入透析袋中，再放入家兔肠腔进行孵育，其目的是使病原菌在肠腔中感受不同于体外的肠道微环境及生存压力，进而研究细菌在适应肠腔环境中所发生的蛋白表达改变。实验分别制备了回收自盲肠、结肠及回肠末端共三个部位的全菌蛋白样品，与体外对照的蛋白样品一起，进行双向电泳分离，取差异表达的蛋白点进行质谱鉴定。结果显示在回肠末端与结肠的全菌蛋白表达基本一致，与体外相比，发现9个重复性较好的差异表达蛋白，其中OmpA、YgiW、MglB、YfiD、MetK、TktA和AhpF在体内表达上调，而 GlnH和ElaB在体外表达较高。盲肠与体外的表达差异明显较回肠与体外的少，仅发现三个差异表达蛋白，分别是 OmpA和 YgiW在体内表达上调，GlnH在体外表达上调。这是志贺氏菌第一次从兔肠回收样品的体内/外比较蛋白组学研究。可以认为，在体内缺氧环境下，厌氧相关的酶YfiD和TktA表达上调；在肠腔中面临过氧化物如ROS的刺激时，细菌应激相关的蛋白如YgiW、MetK和OmpA表达明显上调，这些变化都是细菌为了适应宿主环境所做的改变。　　前期兔肠结扎透析袋模型，志贺氏菌与宿主肠道上皮没有直接接触，目的是为了研究志贺氏菌在适应肠道环境过程中所发生的表达改变。在此基础上，为了研究志贺氏菌在侵袭宿主肠道上皮并引起肠道黏膜损伤的过程中细菌的表达谱改变，我们采取了新的兔肠结扎实验方案，将菌液直接注入提前结扎的肠段内，使细菌直接与肠上皮细胞接触。后回收细菌，与体外细菌样品一起，分别提取total RNA用于转录组测序，并制备全菌蛋白样品用于蛋白质组学研究。为了更全面合理地研究志贺氏菌的毒力调控与致病机理，301野生株（毒株）是主要的研究对象，同时，我们还以毒力大质粒缺失株301△pCP（无毒株）作为对照，进行实验制样及对比研究。转录组三次测序得到的有效数据量体内外分别为751M和595M、777M和794M、及533M和646M，平均覆盖度均在百倍以上，测序深度在平均覆盖度（100倍）以上的基本可认为是明显表达的基因，数量均在2000个左右，测序质量总体较好。（1）体内外差异表达分析上，发现野生株两次测序重复性较好的差异表达基因有143个，其中65个体内上调，78个体外上调，其中有soxS、ebgR、nikC/D、yfeC/D、ygiB/C、sf4294、sf2709和cp0193等在两次野生株的体内外转录谱中均是在体内明显上调的，且在301△pCP中的表达则无明显差异，说明这些基因的表达可能在野生毒株侵袭破坏家兔肠道上皮过程中发挥重要作用。（2）新转录本的筛选预测分析，筛选到103个候选新转录本。其中有些典型的新转录本在两次野生株测序数据中，均是体内表达明显高于体外，而在301△pCP的测序中则无明显差异，暗示这些新转录本在细菌侵袭宿主过程中具有重要作用。　　蛋白质组方面，我们对两次的301野生株体内外全菌蛋白样品分别进行了TMT标记的和非标记（label-free）的定量蛋白质组分析。TMT蛋白组学共鉴定到1649个蛋白，体内外差异表达蛋白分别有50个在体内上调，9个在体外上调。非标记（label-free）的定量蛋白质组共鉴定到1469个蛋白，体内外差异表达蛋白分别有12个在体内上调，16个在体外上调。定量蛋白质组鉴定到差异蛋白与转录组体内外差异相比，发现只有8个共同的差异表达蛋白。　　结合转录组与蛋白质组鉴定到的差异，我们先后挑选了9个典型的差异表达基因（soxS、ebgR、nikC/D、yfeC/D、ygiB/C、sf4294、frdB、mltD和 cp0193）及2个候选的新转录本（cjq1和pj0025），用λ-RED同源重组的方法进行基因敲除，并对敲除后的基因缺失株用豚鼠角膜实验、小鼠肺侵袭实验进行了毒力评价，此外还结合本研究III型分泌系统的诱导分泌实验，对各缺失株进行了诱导分泌检测，结果发现ebgR和yfeC/D基因缺失株的毒力减弱，说明这两个基因很可能与志贺氏菌的毒力密切相关。　　综上所述，本研究在整体水平上，利用兔肠结扎动物模型，结合组学研究技术，对志贺氏菌体内/外不同环境下的差异表达进行了分析，确定了一批体内/外表达差异明显的基因；在分子水平上，通过构建mxiE相关基因的缺失株与过表达株，以及ipaB/ipaD的缺失株，并进行诱导分泌，最终检测到3个尚未报道过的后期效应分子。对这些体内外差异表达基因和鉴定到的新的效应蛋白的进一步结构与功能研究，将为志贺氏菌的致病机制的探究找到新的突破口。另外，本研究运用的组学研究技术、尤其是转录组高通量测序分析可为病原微生物的研究提示新的思路与方法。