【摘 要】
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先天免疫是动物应对微生物侵染的重要防御机制之一。昆虫因没有特异性免疫的存在,先天免疫在昆虫抵御外来微生物等入侵中发挥至关重要的作用。鸡肠炎血清型沙门氏杆菌（Salmonella enterica）具有较广的宿主谱,除了侵染鸡形目外,还可以在高等哺乳动物中传播。然而,它在易感宿主中具有较强的致病性,容易造成宿主的病变甚至死亡,不利研究宿主的防御机制。因此需要引入一个中介模型以克服其中的弊端,而果蝇已
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先天免疫是动物应对微生物侵染的重要防御机制之一。昆虫因没有特异性免疫的存在,先天免疫在昆虫抵御外来微生物等入侵中发挥至关重要的作用。鸡肠炎血清型沙门氏杆菌（Salmonella enterica）具有较广的宿主谱,除了侵染鸡形目外,还可以在高等哺乳动物中传播。然而,它在易感宿主中具有较强的致病性,容易造成宿主的病变甚至死亡,不利研究宿主的防御机制。因此需要引入一个中介模型以克服其中的弊端,而果蝇已被证实是研究此类病原的理想模型。本文利用鸡肠炎血清型沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞后,进行转录组测序,发现果蝇先天免疫等信号通过大规模上调;在此基础上,我们深入解析了该病原菌与宿主S2细胞的免疫互作机制,已经取得研究结果如下:1.肠炎沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞3 h和6 h后,q PCR和荧光观察的结果显示:肠炎沙门氏杆菌可以成功地侵染果蝇S2细胞,并在细胞内发生增殖;细胞形态观察结果显示:果蝇S2细胞被肠炎沙门氏杆菌侵染24小时内并未发现明显的病变现象。2.肠炎沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞3 h和6 h后,对果蝇S2细胞进行转录组测序分析,发现果蝇S2细胞的大部分免疫相关基因发生显著性上调;与此同时,涉及其他功能的基因也发生明显的变化,并且随着侵染时间的延长,差异基因数目逐渐增多。q PCR验证上调的抗菌肽基因显示变化趋势与转录组数据基本一致。3.在肠炎沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h后,进行自噬标记性蛋白Dm Atg8和自噬特异性底物Dm Ref（2）P/Dmp62的蛋白免疫印迹检测,结果显示:在肠炎沙门氏杆菌侵染后,果蝇S2细胞的Dm Atg8a–PE水平在1 h～5 h内逐渐增加;在6 h后,Dm Atg8a–PE水平与5 h相比虽有回落,但是与0 h比较仍显著增加;Dm Ref（2）P/Dmp62的变化趋势则恰好与Dm Atg8a–PE相反。此外,肠炎沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞3 h后,Lyso Tracker染色显示果蝇S2细胞溶酶体的酸化增强。4.在肠炎沙门氏杆菌侵染果蝇S2细胞3 h后,检测了肽聚糖识别蛋白PGRP-L型家族成员转录水平的变化,结果显示:PGRP-L型家族中的Dm PGRP-LB、Dm PGRP-LC以及Dm PGRP-LD显著上调。三者分别过表达后,只有Dm PGRP-LC、Dm PGRP-LD在抵御肠炎沙门氏杆菌侵染的过程中发挥作用。5.检测Dm PGRP-LC、Dm PGRP-LD与宿主细胞自噬和抗菌肽的关系发现,Dm PGRP-LC和Dm PGRP-LD在果蝇S2细胞抵御肠炎沙门氏杆菌侵染的过程中调控Imd信号通路下游抗菌肽的表达;此外,Dm PGRP-LD还促进了细胞自噬的发生。6.蛋白质谱鉴定了Dm PGRP-LD的结合蛋白,结果显示:Dm PGRP-LD在肠炎沙门氏杆菌与果蝇S2细胞互作的过程中与多条细胞信号通路有潜在结合,主要包括自噬、泛素化、内吞、吞噬等。7.分离和纯化了肠炎沙门氏杆菌的胞外多糖,处理果蝇S2细胞3 h后发现PGRP-L家族成员的变化趋势与肠炎沙门氏杆菌侵染后的变化趋势基本一致。进一步利用纯化的主要成分EPS5（extracellular polysaccharides）处理后,Dm PGRP-LB、LC和LD受到显著诱导。通过分子量测定和单糖组成分析发现EPS5是由甘露糖、半乳糖和葡萄糖以7:2.7:1的比例复而成。综上所述,致病性肠炎沙门杆菌虽然能够成功地侵染果蝇S2细胞并在细胞内增殖,但是其分泌的胞外多糖在病原与宿主接触前就会被宿主识别,诱导宿主Dm PGRP-LC和Dm PGRP-LD等的表达,进而促进宿主抗菌肽、细胞自噬等免疫通路。通过对这些通路关键节点的解析可以为今后靶向免疫和自噬相关疾病的防控提供理论依据。
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