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研究背景 脊髓缺血性损伤是严重的脊髓继发性损伤,创伤、动脉硬化、血管畸形、炎症、血管梗塞及各种产生脊髓压迫的疾病都可造成不同程度的脊髓缺血性损伤,尤其在主动脉手术后,是术中钳夹主动脉导致脊髓血液供应暂时性减少造成。最近报道显示脊髓缺血性损伤发生率约3%～18%。目前很多学者致力于其机制及神经保护的研究,但仍未有突破性进展。 脊髓缺血性损伤后血中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量增高,血脑(脊髓)屏障受到破坏。血中TNF-α刺激血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)表达增加,从而促使中性粒细胞聚集,并穿越血管进入脊髓组织,发挥致损伤作用。TNF-α具有多种生物活性作用,它不仅在炎症损伤中有重要作用,而且可以诱导细胞的凋亡。TNF-α能与细胞表面传递死亡信号的受体(TNFR)结合,通过蛋白酶途径激活ICE/CED-3家族蛋白酶的级联反应致细胞凋亡。 近些年,虽然很多学者在脊髓缺血性损伤研究中观察到了神经元凋亡的存在,但是并未获得广泛接受,甚至仍有学者对凋亡的存在及其作用提出质疑,同时凋亡具体途径仍未阐明。坏死与凋亡是细胞死亡的两个过程,在脊髓缺血性损伤中,究竟哪种细胞死亡方式是造成病理损害的主要原因,各自具体作用如何,目前尚有争论。 脊髓缺血性损伤作为严重的脊髓继发性损伤,对人体危害极大,如何预防及治疗仍是一个难题。己酮可可碱(PTX)是甲基黄嘌呤衍生物,作为一种新型加介次驴博士学位论文的抗炎药物具有广泛的药理学效应。体外实验显示:PTX能有效抑制TNF一amRNA的表达,降低中性粒细胞的粘附、趋化及活性氧释放等。 本研究利用家兔建立脊髓缺血性损伤模型,旨在探讨INF一a在脊髓缺血性损伤中的作用及机制,并明确神经元坏死与凋亡在脊髓缺血性损伤中的具体作用;明确在脊髓缺血性损伤中,PTX是否有一定的神经保护作用,并初步探讨其具体途径。 本研究共分为两部分:第一部分:肿瘤坏死因子a(TNF一a)在脊髓缺血性损伤中致神经元坏死与凋亡的双重作用;第二部分:己酮可可碱(PTX)对脊髓缺血性损伤中神经元的保护作用。 研究方法 第一部分:采用兔腹主动脉夹闭法建立脊髓缺血性损伤模型。取日本大耳白兔共78只,随机分为三组:A组(假手术组)18只,只开腹而不夹闭血管;B组(缺血组)30只,夹闭腹主动脉45分钟;C组(anti INF一a mAb处理组)30只,于夹闭腹主动脉前10分钟耳缘静脉注射抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体 (anti诩F一amAb)3mg·kg一,。于损伤后1小时、4小时、12小时、24小时、45小时、72小时不同时间点检测血TNF一a含量,组织MPO活性,免疫组化法观察并检测PECAM一1及Caspase一3表达强度,HE染色观察神经元形态变化并计数坏死细胞,TljNEL荧光染色观察并计数凋亡细胞,电镜观察坏死及凋亡神经元形态改变,电泳观察脊髓组织DNA改变情况。 第二部分:建立脊髓缺血性损伤动物模型方法同第一部分。日本大耳白兔72只,随机分为四组:A组(假手术组)12只,只开腹而不夹闭血管;B组(对照组)20只,夹闭腹主动脉,于夹闭血管前10分钟耳缘静脉注射生理盐水3ml;c组(PTx处理I组)20只,于夹闭血管前10分钟耳缘静脉注射PTx 30mg·kg一,;D组(PTx处理n组):20只,于损伤后即时耳缘静脉注射PTx 30mg·kg一,。每组取动物8只,分别于脊髓缺血前巧分钟、缺血中30分钟、缺血后30分钟耳缘动脉采血2ml,进行血气分析及血糖检测。于损伤后12小时、24小时、48加声,次掌博士学位论文小时、72小时检测血TNF一a活性,组织MPO活性,免疫组化法观察并检测PEcAM一1及caspase一3表达强度,HE染色观察神经元形态变化并计数坏死神经元,TIJNEL染色观察并计数凋亡神经元,于损伤后48小时进行运动功能评分 (改良lhrlov评分),取损伤后72小时脊髓组织进行TTC染色观察并分析有活性脊髓灰质面积。 各数值以均数士标准差(万士s)表示,组间采用单因素方差分析,组内采用配对T检验,应用SAS 8.0软件处理。 结果 第一部分:B组(缺血组)血TNF一a于损伤后1小时即开始升高,4小时达高峰;组织中MPO活性于损伤后即开始增高,至72小时仍维持于较高水平;PECAM一1于血管内皮细胞表达并且以管腔内侧细胞膜及细胞连接处明显,与TNF一a时相一致;CasPase一3于神经元胞浆中表达,于损伤后12小时始有表达,72小时后即明显转低;HE染色切片中于损伤后1小时即有坏死神经元出现,数量较多;TIJNEL染色中见凋亡神经元于损伤后24小时始出现,72小时后即明显减少,凋亡神经元计数明显低于坏死神经元。C组(anti INF一a mAb处理组)血TNF一a含量、组织中MPO活性、免疫组化PECAM一1和Caspase一3表达强度、坏死及凋亡神经元计数均明显低于B组(尸<0 .05)。在B组及C组中,电镜下可观察到坏死及凋亡神经元;DNA电泳未能观察到凋亡“DNA Ladder”,而仅观察到坏死神经元DNA形成的“Smear”。A组未见血TNF一a含量及组织中MPO活性增高;免疫组化见PEcAM一1极少量表达,未见CasPase一3表达;未见坏死及凋亡神经元。 第二部分:PTX治疗组(C组及D组)改良r几rlov评分明显高于对照组 (P<0.05);TTC染色脊髓有活性组织面积大于对照组(尸<0.05);血TNF一a、组织MPO含量、免疫组化PEcAM一1及CasPase一3表达强