余甘子作为一味天然传统中药材,具有丰富的营养价值与药理活性,尤其在抗炎、抗氧化方面效果更为突出,但其抗炎药效物质基础及作用机制还未完全清楚。本实验室前期从余甘子中筛选出了抗炎活性较强的提取部位,经化学和药效分析发现山奈酚、圣草酚和野黄芩素是其中具有抗炎活性的主要成分,但其作用机制还有待进一步研究。为此,本文研究并比较了余甘子中三种单体的抗炎作用,并深入探究了其作用机制。本实验以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞体外炎症模型为平台,主要研究了一定浓度范围和作用时间内圣草酚、山奈酚和野黄芩素的抗炎功效及作用机制。首先利用Griess Reagent试剂检测三种单体对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO分泌的影响;其次采用实时荧光定量PCR技术检测促炎因子TNFα、IL-6、IL-1β和i NOS的m RNA表达;同时采用ELISA技术检测TNFα、IL-6和IL-1β的蛋白分泌水平;最后运用Western Blotting方法检测炎症介质i NOS和COX-2的蛋白表达,并在此基础上进一步探究三者对炎症相关信号转导通路NF-κB、MAPK和JAK-STAT的影响,以及能否通过Nrf2/HO-1抗氧化途径调节炎症反应。实验结果发现,与LPS模型组比,不同浓度的三种单体均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的释放和i NOS m RNA的表达。但是,针对促炎因子TNFα、IL-6和IL-1β在分子和蛋白水平表达的情况,三种单体效果各异。三者都对TNFα的m RNA表达具有促进作用;对于IL-6 m RNA的表达,圣草酚具有促进作用,而山奈酚和野黄芩素具有抑制作用;同时,三者均对IL-1β的m RNA表达具有显著的抑制作用。ELISA结果显示,三种单体都不影响TNFα蛋白的分泌,但都显著抑制IL-6和IL-1β蛋白的分泌。提示圣草酚、山奈酚和野黄芩素通过抑制LPS诱导的NO释放、IL-6和IL-1β的分泌发挥抗炎作用。Western Blotting结果显示,三种单体均显著抑制i NOS蛋白的表达;此外,山奈酚和圣草酚还可明显抑制LPS诱导产生的炎症相关蛋白COX-2的表达。进一步的抗炎机制研究表明,三种单体均可抑制LPS诱导的ERK、JNK信号通路的激活,明显降低ERK和JNK的磷酸化水平。与此同时,三者还显著抑制JAK-STAT信号通路的激活,明显削弱STAT1酪氨酸701位点和STAT3酪氨酸705位点的磷酸化水平,并能进一步抑制STAT1/3转录因子向细胞核的易位。同时,山奈酚和野黄芩素可以抑制LPS引发的NF-κB信号通路中p65的活化及核转移,而圣草酚无此效应。最后,三种单体均能显著上调抗氧化相关基因HO-1的蛋白表达以及促进Nrf2转录因子的入核。综上所述,山奈酚和圣草酚抗炎效果较强,野黄芩素效果较弱。同时,三种单体均通过抑制JAK-STAT信号通路、MAPK中的JNK、ERK信号通路以及激活Nrf2/HO-1抗氧化途径达到抑制炎症因子NO、IL-6和IL-1β释放的作用。此外,山奈酚和野黄芩素还可以通过抑制NF-κB通路调节炎症反应。本研究为余甘子和余甘子中的三种单体圣草酚、山奈酚和野黄芩素的资源利用提供了科学依据,也为余甘子中药现代化提供了药效物质基础和作用靶点方面的实验素材。