【摘 要】
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CRISPR/Cas9是一种最新的基因编辑工具,具有效率高、操作便捷等优势,在基因治疗领域备受关注。通过基因编辑可以精确修复遗传突变,实现修复后基因的稳定表达,较之传统基因治疗方法有显著优势。苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传代谢疾病,主要由肝脏内编码苯丙氨酸羟化酶的Pah基因突变引起的。研究表明苯丙酮尿症需要修复10%以上的肝脏细胞才可能被治愈,是体内基因治疗的经典模型。本课题以具临床代表性的突变
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CRISPR/Cas9是一种最新的基因编辑工具,具有效率高、操作便捷等优势,在基因治疗领域备受关注。通过基因编辑可以精确修复遗传突变,实现修复后基因的稳定表达,较之传统基因治疗方法有显著优势。苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传代谢疾病,主要由肝脏内编码苯丙氨酸羟化酶的Pah基因突变引起的。研究表明苯丙酮尿症需要修复10%以上的肝脏细胞才可能被治愈,是体内基因治疗的经典模型。本课题以具临床代表性的突变类型Pah R408W苯丙酮尿症小鼠为模型,尝试多种基于基因编辑的治疗策略,以期为苯丙酮尿症的治疗,乃至大多数肝脏疾病的治疗寻找更加有效的基因治疗策略。本课题首先选择临床上广泛使用的、安全的腺相关病毒（AAV）作为递送载体,通过全身递送Cas9/sg RNA和同源重组模板的治疗策略,原位修复单碱基突变位点。经过一段时间治疗,模型小鼠中突变基因的平均修复效率为0.11%,血液Phe浓度从1500μmol/L降到950umo/L左右,将经典的苯丙酮尿症转变为中度苯丙酮尿症,但没能实现治愈。为了提高重组修复效率,在此治疗体系的基础上,通过同时注射编码AAV受体（AAVR）的病毒,期望通过提高AAV病毒感染效率从而提升体内编辑效率。结果表明,共注射AAVR的疾病小鼠的突变基因的平均修复效率为3.13%,平均血液苯丙氨酸浓度也降到777.84 umo/L左右,成功提高了治疗效果。为了进一步提高AAVR治疗策略的安全性,我们又尝试删除部分结构域的受体（mini AAVR）来代替AAVR。综上所述,本课题以苯丙酮尿症小鼠为基因治疗模型,通过多种策略提高基因编辑修复效率,为今后临床上苯丙酮尿症开展基因治疗提供了不同的策略和有效提高效率的方法,该方法也有望推广到更多的肝脏相关疾病的基因治疗研究中。
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