【摘 要】
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目的:1.探究巴马汀在体外和体内的抗结直肠癌活性;2.探究巴马汀抗结直肠癌的作用机制。方法和结果:1.从黄连中提取、分离和纯化得到巴马汀。首先通过5%的酸水渗漉的方法提取出黄连中生物碱混合物,然后用二氯甲烷对生物混合物进行萃取后烘干得到含有巴马汀的浸膏;通过硅胶色谱柱法梯度洗脱分离浸膏中各种生物碱成分并收集巴马汀部位;通过凝胶色谱法对巴马汀部位进一步纯化,最后通过核磁共振和高效液相色谱法对纯化的巴
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目的:1.探究巴马汀在体外和体内的抗结直肠癌活性;2.探究巴马汀抗结直肠癌的作用机制。方法和结果:1.从黄连中提取、分离和纯化得到巴马汀。首先通过5%的酸水渗漉的方法提取出黄连中生物碱混合物,然后用二氯甲烷对生物混合物进行萃取后烘干得到含有巴马汀的浸膏;通过硅胶色谱柱法梯度洗脱分离浸膏中各种生物碱成分并收集巴马汀部位;通过凝胶色谱法对巴马汀部位进一步纯化,最后通过核磁共振和高效液相色谱法对纯化的巴马汀进行结构鉴定和纯度鉴定。最终得到802 mg纯化的巴马汀,巴马汀纯度为94.6%。2.探究巴马汀在体内外抗结直肠癌的活性。通过MTT实验检测巴马汀对结直肠癌细胞活力的影响;通过克隆形成实验检测巴马汀对结直肠癌细胞克隆形成的影响;通过ki-67染色实验检测巴马汀对结直肠癌细胞增殖相关蛋白ki-67表达的影响。通过皮下注射HCT-116细胞建立异种移植瘤裸鼠模型评价了巴马汀在体内抗结直肠肿瘤的活性。MTT实验、克隆形成实验和ki-67染色实验结果证明巴马汀在体外以剂量依赖方式抑制结直肠癌细胞的增殖;体内实验结果表明巴马汀在体内以剂量依赖方式抑制结直肠肿瘤的生长。3.探究巴马汀抗结直肠癌的作用机制。在TCGA数据库下载结直肠癌临床样本的基因表达矩阵并进行差异基因分析,将差异基因进行GSVA富集分析探究结直肠癌的发生发展机制;分别在Swiss Dock和Pharm Mapper数据中进行分子对接预测巴马汀药物靶点;在DAVID数据库中对巴马汀药物靶点进行疾病富集分析筛选出巴马汀抗结直肠癌的靶点;在Dep Map数据中对巴马汀抗结直肠癌的靶点进行依赖性分析筛选出显著影响结直肠癌的靶点;分别在Timer和GEPIA数据中对显著影响结直肠癌的靶点进行基因表达量分析和生存分析;通过GSEA富集分析巴马汀抗结直肠癌靶点影响的下游通路。结果表明在结直肠癌样本中P53、内皮细胞凋亡等信号通路发生下调,而与细胞周期、DNA的复制、脂肪酸代谢调控有关的信号通路发生上调;巴马汀主要通过靶向AURKA发挥抗结直肠癌功能;巴马汀通过靶向AURKA诱导结直肠癌细胞周期阻滞和凋亡。4.证明巴马汀通过靶向AURKA发挥抗结直肠癌功能。通过蛋白免疫印迹实验检测了巴马汀对结直肠癌细胞中AURAK及其下游调控凋亡蛋白P53/P73、Caspase3、Caspase9表达的影响;通过Tunel实验和流式细胞术检测了巴马汀对结直肠癌细胞凋亡和周期的影响;在AURKA过表达后通过MTT实验检测巴马汀对结直肠癌细胞活力的影响;在AURKA过表达后通过流式细胞术检测了巴马汀对结直肠癌细胞凋亡的影响。蛋白免疫印迹实验和Tunel实验证明巴马汀降低了结直肠癌细胞中AURKA的表达且促进了结直肠癌细胞的凋亡;流式细胞术实验结果表明巴马汀以剂量依赖方式诱导结直肠癌细胞周期阻滞和凋亡;MTT实验和流式细胞术实验结果表明在AURKA过表达后巴马汀对结直肠癌细胞活力和凋亡的影响显著降低。综上实验结果表明巴马汀通过靶向AURKA发挥抗结直肠癌功能。5.探究巴马汀诱导结直肠癌细胞凋亡的分子机制。通过流式细胞术检测了巴马汀对结直肠癌细胞内ROS的产生和线粒体膜电位的影响;通过蛋白免疫印迹实验检测了巴马汀对结直肠癌细胞和异种移植瘤中线粒体凋亡相关蛋白Cyt.c、Bcl2、Bcl-xl、BID、FADD和Caspase8表达的影响;通过蛋白免疫印迹实验检测了巴马汀对结直肠癌细胞和异种移植瘤中AURKA及下游蛋白P53/P73、Caspase3和Caspase9表达的影响;通过q PCR实验检测了巴马汀对AURKA过表达的结直肠癌细胞中TP53、Casp3和Casp9 m RNA含量的影响。ROS、线粒体膜电位和线粒体相关凋亡的实验结果表明巴马汀通过线粒体相关途径诱导结直肠癌细胞凋亡;通过免疫组化实验检测了在肿瘤组织中巴马汀对P53、Caspase3和Caspase9蛋白水平的影响。AURKA及其下游调控蛋白的检测、q PCR实验和免疫组化的结果进一步证明巴马汀通过靶向AURKA诱导结直肠癌细胞凋亡;综上实验结果表明巴马汀可能通过靶向AURKA诱导结直肠癌细胞发生线粒体相关途径凋亡。结论:巴马汀可能通过靶向AURKA诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞和线粒体相关途径凋亡。
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