背景 目前体外分化的人呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell, HAEC)已被广泛应用于新发呼吸道病毒的鉴定、宿主与呼吸道病原体间相互作用和呼吸系统疾病的研究中。猪是许多人呼吸道病毒感染的天然宿主,在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都与人类有相似之处,因此猪可作为研究呼吸道病毒感染和呼吸系统疾病药物筛选的理想模型。目的构建猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell, PAEC)体外分化模型,鉴定其形态学和生理学特征及其在转导外源基因方面的应用。方法本研究采用蛋白酶低温消化分离猪气管和支气管上皮细胞,接种至I/III型胶原蛋白包被的细胞培养皿中,使用添加多种细胞生长因子的无血清培养基进行原代培养。细胞接种至IV型胶原蛋白包被的半透膜支持物上,采用气液界面培养法进行猪呼吸道上皮细胞的体外分化培养。采用扫描电镜法、电生理和免疫组化等方法检测和鉴定培养物的细胞组成和形态学特性以及其表面典型的细胞标志蛋白。腺相关病毒(Adenoassociated virus, AAV)具有免疫原性低和可介导外源基因长期表达的特性,在基因治疗领域有广阔的应用空间。本实验研究中将pXX680, pXR6, PSC-GFP三种质粒按照6：5：3的比例转染至293T细胞,培养48h后,收获含重组腺相关病毒rAAV6-GFP的293T细胞。利用两步氯化铯梯度离心纯化重组rAAV6-GFP病毒并感染分化成熟的猪呼吸道上皮细胞,研究AAV6在该模型上的转导效率,验证AAV6能否有效地介导外源基因表达。结果结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,其顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底层细胞。PAEC模型的电生理学特性-上皮细胞跨膜电阻在一定时期内保持稳定,表明PAEC细胞间连接的形成和跨细胞间离子运输的平衡。本研究通过三质粒共转染法成功制备了重组腺相关病毒rAAV6-GFP,其能够通过顶端表面感染PAEC,有效地转导呼吸道上皮细胞。结论本文构建的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型能够模拟人呼吸道的生理学和形态学特征,为呼吸道病原体感染机制、呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。