第一部分 谷氨酰胺对肺泡Ⅱ型细胞热休克蛋白70表达的影响 目的:研究谷氨酰胺不同浓度以及不同作用时间对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549热休克蛋白(HSP)70表达的影响。 方法:人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549生长至铺满80﹪瓶底时更换不含胎牛血清的DMEM培养液培养过夜，使细胞处于一相对静止生长状态，然后用于下一步实验。细胞在含有不同浓度(0、2、4、8、12和16mmol/L)谷氨酰胺的DMEM培养液中培养24h，收取细胞；同一批的另一组细胞在含8mmol几谷氨酰胺的DMEM培养液中分别培养不同时间(1、2、6、12、24和48h)后，收取细胞；以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞24h作为空白对照(C组)；以43℃孵育1h，37℃恢复4h的细胞作为阳性对照(G组)。采用RT-PCR和Western免疫印记法分别检测HSP70 mRNA和蛋白的表达情况。 结果:(1)与C组相比，谷氨酰胺不同浓度各组HSP70 mRNA和蛋白表达明显增强，并具有浓度依赖性，在8mmol/L时达峰值(HSP70 mRNA：293±17.74，P<0.01：HSP70蛋白：10.42±2.51，P(0.01)；与G组相比，8mmol/L时HSP70 mRNA表达水平增高，差异有显著性(P<0.01)；(2)与C组相比，8mmol/L谷氨酰胺作用lh时HSP70 mRNA和蛋白表达即开始增高，在24h处达峰值，48h仍维持较高水平(HSP70 mRNA：191±17.45，P(0.01；HSP70蛋白：7.33±1.67，P<0.01)。 结论:谷氨酰胺可明显上调体外培养肺泡Ⅱ型细胞系A549HSP70 mRNA和蛋白的表达，并具有浓度和时间依赖性。 第二部分 谷氨酰胺预处理对过氧化氢诱导肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响 目的:研究8mmol/L谷氨酰胺预处理12h对过氧化氢诱导的肺泡Ⅱ型细胞系A549 HSP70蛋白表达和细胞凋亡的影响。 方法:人肺泡Ⅱ型细胞系A549生长至铺满80﹪瓶底时，在不含胎牛血清的DMEM培养液中培养过夜，使细胞处于-相对静止生长状态，然后细胞分为四组：(1)空白组(C组)：以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞12h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5h，收取细胞；(2)单纯谷氨酰胺组(Gln组)：以含谷氨酰胺8mmol/L的DMEM培养液培养细胞12h后，与过氧化氢同体积生理盐水加入培养液继续培养5h，收取细胞；(3)单纯过氧化氢刺激组(H<,2>O<,2>组)：以不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞12h后，培养液中加入终浓度为400 μ mol/L过氧化氢刺激5h，收取细胞；(4)谷氨酰胺预处理后过氧化氢刺激组(G1n+H<,2>O<,2>组)：以含谷氨酰胺8mm01/L的DMEM培养液培养细胞12h后，过氧化氢400 μ mol/L刺激5h，收取细胞。采用Western免疫印记法检测HSP70的表达情况，流式细胞仪膜联蛋白V(Annexin-V)法检测细胞凋亡情况。 结果:与C组(1.87±0.55)相比，Gln组(8.42±1.38)、H<,2>O<,2>组(9.35±1.57)和Gln+H<,2>O<,2>组(13.12±1.85)细胞HSP70表达分别增高约4.5倍、5倍和7倍，差异有显著性(P<0.01)；与H<,2>O<,2>组相比，Gln+H<,2>O<,2>组表达进一步增高，差异有显著性(P<0.01)。与C组相比，Gln组细胞总凋亡率无明显变化(P>0.05)；H<,2>O<,2>组和Gln+H<,2>O<,2>组细胞总凋亡率明显增高，分别为7.48±0.53﹪和6.06±0.39﹪，约为C组的1.6倍和1.3倍(P<0.01)；与H<,2>O<,2>组相比，Gln+H<,2>O<,2>组细胞总凋亡率降低(P<0.01)。 结论:谷氨酰胺8mmol/L预处理12h对过氧化氢诱导的A549细胞凋亡有明显抑制作用，并且明显上调此时A549细胞HSP70的表达。