研究背景子宫肌瘤(Uteruine Myoma)是女性生殖系统最常见的良性肿瘤,临床发病率高达20%-40%,其主要临床症状包括生殖道出血、不孕、流产及贫血,给患者带来了巨大的痛苦并严重影响其生活质量。子宫肌瘤主要是由子宫平滑肌细胞增生而成,其发病机制复杂,较传统的观点认为子宫肌瘤是由于性激素(主要是雌性激素)及局部生长因子间较为复杂的相互作用,导致子宫平滑肌细胞异常增生的结果。然而,随着近年来研究的逐渐深入,子宫肌瘤患者子宫平滑肌细胞存在的异常收缩现象表明,肌球蛋白(Myosin)的功能异常可能在子宫肌瘤发病中起到了重要作用。作为肌原纤维粗丝的组成单位,肌球蛋白存在于平滑肌细胞中,在肌肉运动中发挥重要功能,因此,myosin的功能异常与子宫肌瘤的发病机制间的相关性就成为本课题的研究重点。平滑肌细胞以“肌丝滑动”原理进行收缩,其每个收缩单位是由粗肌丝(肌球蛋白)和细肌丝(肌动蛋白)组成,当平滑肌细胞收缩时,粗细肌丝相互重叠,肌原纤维成螺旋形扭曲而使平滑肌细胞变短增粗。Myosin是粗肌丝的基本组成蛋白,大约由200-250个分子聚集而成,形成长约1.5μm的粗丝；同时myosin也是各类肌细胞中含量最多的结构蛋白和收缩蛋白,约占其总蛋白库的25%,因此,myosin在肌肉收缩的调控中发挥了重要作用。myosin是一个六聚体的大分子蛋白质,由两条Mr约为220,000的重链(Myosin Heavy Chain, MHC)和几条Mr约为16,000-27,000的轻链(Myosin Light Chain, MLC)组成,每条重链包括一个完整的球状头部(N-末端)及一个长的纤维状a-螺旋尾部(C-末端)；几条MHC大部分以双股α-螺旋盘绕,形成长约1500埃的长棒状,其余部分则和MLC一起构成球形头部；被激活后,myosin成为有活性并能分解ATP的ATP酶。与此同时,目前至少发现了18种肌球蛋白亚型,它们的结构和功能各不相同,共同组成了肌球蛋白超家族蛋白质,因此,作为一种多功能蛋白质,myosin在生物体内发挥了许多重要功能。近年来的研究表明,myosin的表达与功能异常与平滑肌细胞异常增殖、侵袭和形态功能紊乱密切相关；与此同时,肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移所需要的细胞外基质的过度分泌也与myosin的功能紊乱密切相关。子宫肌瘤细胞外过量基质的产生和沉积是由肌瘤细胞自身合成并分泌,这些分布在细胞表面或细胞之间的生物大分子,主要是由一些多糖、蛋白或蛋白聚糖组成,它们构成复杂的网架结构,支持并连接细胞结构,调节组织的发生和细胞的生理活动,其中细胞与基质的粘附是多种蛋白共同跨膜传导细胞力的结果,这些分子可以根据细胞的化学及机械环境来调节细胞内的生化信号,因此,细胞粘附的形成是由多方面因素来调节的,包括肌动蛋白的形成、细胞内myosin的激活及myosin与细胞外基质形成的细胞外力。这种包含了力、信号及机械传感的协同作用共同决定了整个机体的稳态和疾病发生发展历程中的细胞表型变化。因此,myosin不仅参与肌肉运动,为肌肉收缩提供动力,其作为细胞骨架的组成成分,同时参与细胞外基质成分的相互作用并调控细胞的增殖及侵袭过程。在子宫肌瘤患者的子宫肌瘤组织中存在着大量排列和分布紊乱的平滑肌细胞和过量表达的细胞外基质,因此,nyosin的异常是否影响子宫平滑肌细胞的异常增殖及细胞外基质的积聚,从而进一步加剧子宫肌瘤的发病成为本课题的重要研究内容。Myosin可能成为平滑肌细胞收缩通路及增殖通路的中间交叉点,启发我们对子宫肌瘤的发病机理进行更加深入的思考。目前有关myosin在子宫肌瘤的发病机制中的作用尚无深入研究,本课题分两部分探讨myosin在子宫肌瘤中的表达,及在子宫肌瘤发生发展中的作用。第一部分Myosin在子宫肌瘤组织中的表达研究目的通过检测子宫肌瘤和正常子宫平滑肌组织中]myosin各组成成分：肌球蛋白轻链(MLC)、肌球蛋白重链(MHC)及肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)在蛋白和mRNA水平的表达,对比子宫肌瘤组织和正常子宫平滑肌组织中上述三种分子的表达差异,观察myosin在子宫肌瘤组织中是否存在表达异常,为进一步探讨myosin在子宫肌瘤发病机制中的作用奠定基础。研究方法1.采用免疫组织细胞化学方法检测30例子宫肌瘤病人肌瘤组织及30例子宫平滑肌组织中MLC、MHC、MLCK及p-MLCK的表达,比较子宫肌瘤组织及子宫平滑肌组织中上述指标的表达差异。2.采用Real-Time PCR法检测30例子宫肌瘤组织及30例子宫平滑肌组织中MLC、MHC、MLCK及p-MLCK mRNA水平的表达,并比较子宫肌瘤组织及子宫平滑肌组织中以上指标的表达差异。3.采用Western blot法检测30例子宫肌瘤组织及30例子宫平滑肌组织中MLC、MHC、 MLCK及p-MLCK蛋白含量,比较子宫肌瘤组织及子宫平滑肌组织中以上指标的表达差异。研究结果1.免疫组织化学结果显示,子宫肌瘤细胞形态与子宫平滑肌细胞相似,但肌瘤细胞排列比较密集且较为紊乱。免疫组织化学切片染色中出现棕黄色为阳性结果,染色越深表示表达量越高。子宫肌瘤组织与子宫平滑肌组织相比,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK均呈高表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。2. Real-Time PCR法检测子宫肌瘤组织中MLC、MHC和MLCK的表达,子宫肌瘤组织与子宫平滑肌组织相比,MLC、MHC及MLCK在mRNA水平的表达均上调,两者比较有显著差异(P<0.05)。3.应用Western Blot法在子宫肌瘤及子宫平滑肌组织中均检测到MLC、MHC、MLCK及p-MLCK相应的蛋白特异性条带,但子宫肌瘤组织中的ML、MHC、MLCK及p-MLCK相对含量显著高于子宫平滑肌组织,差异存在统计学意义(P<0.05)。研究结论在子宫肌瘤组织中,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK均呈高表达,其中MHC在子宫肌瘤组织中的表达变化最为显著。上述结果提示我们,myosin个组成成分的表达异常可能与子宫肌瘤的发病具有相关性。研究意义本实验通过免疫组化、Real-Time PCR及R Western Blot的方法证实了myosin及其上游的MLCK在肌瘤组织中存在表达异常,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK的表达变化能够引起平滑肌细胞排列及收缩功能紊乱,而子宫平滑肌细胞的功能紊乱与子宫肌瘤的发生存在一定的相关性,同时上述研究结果为进一步研究myosin的功异常在子宫平滑肌细胞促增殖及促细胞外基质分泌中的作用奠定了基础。第二部分MHC在调控子宫肌瘤细胞增殖及细胞外分泌中的作用研究目的观察MHC的表达异常对子宫肌瘤细胞增殖紊乱及细胞外分泌功能异常的影响。研究方法运用RNAi技术,敲降编码MHC蛋白的MYH11基因,干扰myosin重链MHC的表达,观察MHC表达下调对子宫肌瘤平滑肌细胞增殖及细胞外分泌功能的影响。我们通过检测细胞增殖相关蛋白,观察MHC与细胞增殖的关系；通过检测细胞外基质蛋白,观察MHC在调控细胞外基质分泌中的作用,从而进一步了解细胞外基质蛋白的表达变化在MHC相关的细胞增殖中的作用。1.采用贴壁细胞培养方法体外培养子宫肌瘤细胞。2.制备含有MYH11siRNA的慢病毒。3.将制备好的慢病毒转染体外培养的人子宫肌瘤细胞,转染后72h用荧光显微镜观察转染细胞比率。根据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达后发绿色荧光的特点,在荧光显微镜下观察GFP的表达情况。4.采用RT-PCR方法检测转染含有MYH11siRNA的慢病毒后子宫肌瘤细胞与对照组子宫肌瘤细胞中MHC的mRNA水平,检测干扰效率。5.采用MTT法检测MYH11RNAi后子宫肌瘤细胞及对照组子宫肌瘤细胞的增殖情况,分析MYH11RNAi对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响。6.Western-blot法检测MYH11RNAi前后子宫肌瘤细胞中增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、P53及丝氨酸／苏氨酸激酶AKT的表达变化,进一步观察MHC表达缺失对肌瘤细胞增殖的影响。7.Real-Time PCR法检测MYH11RNAi前后子宫肌瘤细胞组和对照组子宫肌瘤细胞中胶原蛋白I、IGF-1、纤连蛋白、EGF及蛋白多糖mRNA的表达,分析MHC表达下调对子宫肌瘤细胞胶原蛋白I、IGF-1、纤连蛋白、EGF及蛋白多糖mRNA表达的影响。8. ELISA法检测MYH11RNAi后子宫肌瘤细胞和对照组子宫肌瘤细胞中胶原蛋白Ⅰ、IGF-1、纤连蛋白、EGF及蛋白多糖的表达,分析MHC表达下调对于肌瘤细胞胶原蛋白Ⅰ、IGF、纤连蛋白、EGF及蛋白多糖表达的影响。研究结果1.体外培养的子宫肌瘤细胞在显微镜下观察细胞呈梭形,状态良好。2.转染含有MYH11siRNA的慢病毒成功的子宫肌瘤细胞在显微镜下可以观察到绿色荧光,通过荧光显微镜计数感染效率大于70%。3RT-PCR方法检测子宫肌瘤细胞转染含有MYH11siRNA的慢病毒72h后,MHC的mRNA的表达量与对照组相比下降约72%,因此我们认为已成功下调MHC的表达。4.MTT法检测子宫肌瘤细胞的增殖结果显示,在转染后72h, MYH11RNAi组子宫肌瘤细胞增殖效率与对照组子宫肌瘤细胞组相比明显下降,差异存在统计学意义(P<0.05)。5. Western-blot结果显示,MYH11RNAi组子宫肌瘤细胞中PCNA、 p-AKT及AKT的表达均较对照组子宫肌瘤细胞中降低,而P53的表达则是MYH11RNAi组高于对照组子宫肌瘤细胞,各组之间均存在统计学差异(P<0.05)。6.RT-PCR检测结果显示,干扰MYH11的表达降低了子宫肌瘤细胞外基质胶原蛋白Ⅰ的表达(P<0.05)；干扰组子宫肌瘤细胞中IGF-Ⅰ的表达也较对照组子宫肌瘤细胞明显减少(P<0.05)；干扰组纤连蛋白表达较对照组子宫肌瘤肌瘤细胞明显下降(P<0.05)；而干扰MYH11的表达使得子宫肌瘤细胞中EGF的表达较对照组子宫肌瘤细胞明显升高(P<0.05)；蛋白聚糖的表达在干扰组与对照组无明显差异(P>0.05)。7.ELISA法检测MYH11RNAi24小时、48小时及72小时后子宫肌瘤细胞中胶原蛋白Ⅰ的表达维持在较为稳定的水平,而对照组子宫肌瘤细胞随着培养时间的延长胶原蛋白Ⅰ的表达逐渐升高,故干扰组胶原蛋白Ⅰ的含量在转染24小时、48小时及72小时明显低于对照组,两者比较差异均存在统计学意义(P＜0.05); MYH11RNAi24小时、48小时及72小时后子宫肌瘤细胞中IGF-1的含量均较低,而对照组中IGF-1在24小时及48小时的表达水平较高,72小时下降,但总体而言干扰组IGF-1的含量均低于对照组,两者比较差异均存在统计学意义(P<0.05); MYH11RNAi24小时、48小时及72小时后子宫肌瘤细胞中纤连蛋白的含量及对照组子宫肌瘤细胞的含量均随着时间的延长逐渐升高,但干扰组均低于对照组,两者比较差异均存在统计学意义(P<0.05); MYH11RNAi24小时、48小时及72小时后子宫肌瘤细胞及对照组子宫肌瘤细胞中EGF的含量均逐渐升高,干扰24小时及72小时比较差异存在统计学意义(P<0.05)；MYH11RNAi24小时、48小时及72小时后子宫肌瘤细胞中蛋白多糖的含量逐渐升高,对照组子宫肌瘤细胞蛋白多糖的含量也逐渐增加,干扰组与对照组相比,无明显统计学差异(P>0.05)。研究结论MHC的表达变化能够影响子宫肌瘤细胞对细胞增殖相关蛋白的表达及细胞外基质相关蛋白的分泌,其中PCNA、AKT、胶原蛋白I、IGF-1及纤连蛋白的表达随着MHC表达的下调而明显下降,P53和EGF则明显升高,蛋白多糖的含量并无显著变化。研究意义通过本实验,我们干扰了MHC的表达,直接破坏了myosin的结构及活性后,发现子宫肌瘤细胞增殖能力明显下降；另外,部分细胞外基质蛋白及细胞因子的分泌发生异常,这些蛋白的表达变化可能直接或间接改变平滑肌细胞的生理特性及细胞周围微环境。因此,我们推测nyosin不仅在子宫平滑肌细胞的收缩功能发挥了重要作用,MHC的表达变化对子宫平滑肌细胞的增殖及细胞外基质的分泌等方面都产生了一定影响,从而启发我们对子宫肌瘤的发病机理进行更加深入的研究和探讨。