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目的:胶质瘤是中枢神经系统最常见和恶性程度最高的原发性肿瘤,其具有进展快、易复发、生存期短等突出特征。胶质瘤的生长特点是弥漫性和高侵袭性,大部分胶质瘤患者在接受临床手术切除和放疗后仍极易复发。化学疗法是治疗脑胶质瘤的另一个重要手段,而传统的大剂量应用化疗药物经常导致患者全身的细胞毒性发生,甚至快速产生耐药性,严重影响患者的生存率和生存质量。低频超声可以无创、短暂、可逆、局部地开放血脑屏障,增强药物渗透、吸收的研究,为脑胶质瘤治疗提供了新路径。既往有证据表明TGF-β1/Smad信号通路与脑胶质瘤细胞生物学行为密切相关,但这一过程的形成机制尚不清楚。本研究通过体内和体外同时验证,TGF-β1/Smad信号通路与胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭发生的关系,以及低频超声联合微泡通过TGF-β1/Smad信号通路增强姜黄素对胶质瘤细胞抑制作用的研究。方法:1.1.本研究采用U251、U87、C6三个胶质瘤细胞系作为研究对象。前期将三个细胞系分别分为:空白对照组、单纯姜黄素组、超声+姜黄素组、超声+微泡组、超声+微泡+姜黄素组（联合治疗组）。根据组别,分别给与各细胞系不同处理方式,空白对照组不给予任何处理、单纯加入姜黄素（15μmol/L）、加入姜黄素后给予超声辐照30s（强度142.0m W/cm~2）、加入微泡（微泡计量:1～5×10~6/ml）后给予超声辐照30s、加入微泡和姜黄素后给予超声辐照30s。首先,分别观察各处理组胶质瘤细胞的形态学变化;应用PI染色流式细胞仪检测各组处理细胞的凋亡情况;应用CCK8实验检测各组处理细胞的吸光值,并计算增殖率;利用划痕实验、Transwell侵袭实验观察各组处理细胞的迁移和侵袭能力;应用q RT-PCR和Western Blot检验各组处理细胞的VEGF、NCAM、整合素αvβ3表达差异。1.2.将U251、U87、C6三个细胞系分别进行二次分组。空白对照组:不给予任何处理、rh TGF-β1组:单纯给予rh TGF-β因子（10ng/m L）、联合治疗组:加入微泡（微泡计量:1～5×10~6/ml）和姜黄素（15μmol/L）后给予超声辐照30s、联合治疗+rh TGF-β1组:给予rh TGF-β因子后加入微泡和姜黄素再进行超声辐照30s、抑制剂ITD-1组:给予Smad2/Smad3磷酸化抑制剂（5μmol/m L）。应用q RT-PCR和Western Blot检验各组处理细胞的P-Smad2/Smad3、VEGF、NCAM、整合素αvβ3表达情况。2.动物实验将C6细胞经传代扩增培养至足够数量,加入无血清的DMEM培养液配置成细胞密度为1×10~7细胞/ml的细胞悬液。健康Wistar大鼠25只,体重180±13g。用10%水合氯醛（0.3m L/100g,腹膜内注射）麻醉大鼠。通过开颅手术创建窗口,在立体定位仪的指导下注射C6胶质瘤细胞悬液。将大鼠分为5组（对照组5只,其余每组4只,4只移植瘤失败）,分别于术后7天,接受低频超声处理30s（超声+姜黄素组、超声+微泡组、联合治疗组）,经鼠尾静脉注射姜黄素（超声+姜黄素组、联合治疗组）、经鼠尾静脉注射微泡（超声+微泡组、联合治疗组）和不接受治疗（对照组）。瘤体观察:分别于入组后第1天、治疗后第7天、治疗后第14天利用MRI观察大鼠接种部位肿瘤生长情况。处死大鼠后,留取大鼠肿瘤组织及瘤周组织。利用HE染色观察各处理组肿瘤细胞分布、排列、细胞坏死情况。应用免疫组化检测各处理组肿瘤细胞VEGF、NCAM、整合素αvβ3表达差异。结果:1.1.细胞形态学的变化:各细胞系对照组中的正常胶质瘤细胞显示为长梭形,纺锤形或多边形,细胞边界清晰,并与周围细胞呈网状连接。与对照组相比,其他各处理组出现不同程度的抑制胶质瘤细胞增殖的情况;细胞变小,形态不一,突触减少,细胞间隙增大,出现细胞核碎裂等现象,其中联合治疗组变化显著。细胞增殖抑制率:与对照组相比,各处理组的细胞增殖能力均受抑制（P＜0.05）。而各处理组中,联合治疗组的细胞抑制率明显高于其他各组（P＜0.05,P＜0.0001）。细胞凋亡率:与对照组相比,各处理组中除了超声+微泡组,其余组细胞凋亡明显增加（P＜0.05,P＜0.0001）,联合治疗组的凋亡率明显高于其他各组（P＜0.05,P＜0.0001）。迁移和侵袭能力:各组间的迁移、侵袭能力存在差异,与对照组相比,各处理组迁移、侵袭能力减低,差异有显著意义（P＜0.05,P＜0.0001）。各处理组间,联合治疗组的迁移、侵袭能力显著下降（P＜0.05,P＜0.0001）。与对照组相比,各处理组的VEGF、NCAM、整合素αvβ3表达显著下降,表达量有显著性意义（P＜0.05,P＜0.0001）。与其他处理组比较,联合治疗组的表达量更显著（P＜0.05,P＜0.0001）。1.2.三个细胞系分别进行二次分组处理后,其P-Smad2/Smad3、VEGF、NCAM、整合素αvβ3表达情况:与对照组相比,rh TGF-β1组的表达情况显著升高（P＜0.0001）,联合治疗组和抑制剂ITD-1组的表达下降,表达情况存在差异（P＜0.05,P＜0.0001）。而对照组和联合治疗+rh TGF-β1组,联合治疗组和抑制剂ITD-1组之间表达未见明显差异（P＞0.05）。2.瘤体观察:本实验应用大鼠25只,其中21只形成移植瘤,成瘤率为84%。入组治疗14天后,与对照组相比,其他各组肿瘤生长速度较慢慢（P＜0.05,P＜0.0001）,其中与其他组比较,联合治疗组肿瘤生长速度最慢（P＜0.05）。HE染色观察:与对照组相比,其他各处理组中肿瘤细胞分布减少、排列疏松、甚至出现大片的肿瘤细胞坏死,细胞核碎裂、溶解等现象,其中以联合治疗组表现尤为明显。免疫组化检测:与对照组相比,各处理组肿瘤细胞VEGF、NCAM-L1、整合素αvβ3表达下降,存在显著差异（P＜0.05,P＜0.0001）。姜黄素组和姜黄素+超声组的表达要高于联合治疗组（P＜0.05,P＜0.0001）。结论:综上所述,1.VEGF、NCAM、整合素αvβ3是肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的相关因子,超声联合微泡增强姜黄素对其表达的抑制作用。这种联合应用为脑胶质瘤细胞的治疗提供了新路径。2.P-Smad2/Smad3是TGF-β信号通路传递的关键因子,过表达P-Smad2/Smad3时,其下游VEGF、NCAM-L1、整合素αvβ3表达水平显著增高,联合治疗后可转归这种表达。抑制P-Smad2/Smad3时,其下游因子表达水平与联合治疗组一致。因此,P-Smad2/Smad3可能是超声联合微泡增强姜黄素对脑胶质瘤抑制作用的机制。