随着水产养殖业的发展,水体富营养化日趋严重,这成为阻碍水产养殖业可持续发展的重要因素。蛋白酶是一种水解蛋白质分子肽链的水解酶,可催化分解有机蛋白质大分子。目前已知养殖系统中大部分细菌具有产胞外蛋白酶的能力,但是其菌群结构多样性及其水质改善生态功能等科学问题尚未形成明确定论。本研究拟采用传统平板培养法、16S rDNA鉴定方法和优势细菌的Biolog自动微生物鉴定法相结合,阐明海南文昌对虾养殖水体、底泥、益生菌制剂中产蛋白酶细菌的丰度、种类以及细菌遗传多样性,通过探讨重要水质指标氨氮、亚硝态氮、硝态氮与细菌群落结构的相关性,确定菌群结构的生态功能,这不仅可揭示该系统中产蛋白酶菌菌群结构的多样性,还为今后开发适用于对虾养殖系统的产蛋白酶有益微生物制剂提供菌种资源,为实现对虾的绿色生态养殖奠定基础。本研究采用酪蛋白培养基从海南文昌对虾养殖基地的7个水样中筛选产蛋白酶细菌,结果表明,水体中可培养的产蛋白酶细菌数为6.58×102～2.10×103 CFU/mL,分离获到525株产蛋白酶细菌菌株;对所有菌株进行16S rDNA测序并进行Blastn序列比对,发现这525株细菌分属于变形菌门(Proteobacteria)(占71.6%)、厚壁菌门(Firmicutes)(占 28%)、放线门(Actinobacteria)(占 0.38%)3 个不同门的16个属,其中弧菌属(Vibrio)占61.7%、芽孢杆菌属(Bacillus)占24.2%,这两个属为典型的优势属,欧文斯氏弧菌(Vbrio owensii)(24.7%)和花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)(65.4%)分别为以上两个属的优势种。产酶活性实验表明,所有菌株能降解酪蛋白,38.1%以上的菌株为高产蛋白酶活菌株(D/d≥3),其中绝大多数是弧菌属和芽孢杆菌属菌株。采用同样的方法,从海南文昌对虾养殖基地中的7个底泥样品中筛选产蛋白酶细菌,得到底泥中可培养的产蛋白酶细菌的丰度为2.047×104～2.85×105CFU/g,从底泥样品中共分离得到664株菌,分属于厚壁菌门(占91.57%)、变形菌门(占7.23%)、放线菌门(占1.2%)3个门的20个属,其中芽孢杆菌属(60.6%)、微小杆菌属(Exiguobacterium)(28.6%)、盐芽孢杆菌(Halobacillus)(10.3%)为优势菌群。同时,研究结果还表明,不同养殖池塘水质和底泥中的优势菌种和丰度存在明显差异。产酶活性实验表明,所有菌株能降解酪蛋白白,46.2%以上的菌株为高产蛋白酶活菌株(D/d≥3),且绝大多数为芽孢杆菌属菌株。益生菌制剂来源的67株菌均为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和B.paralicheniformis。这些菌种对酪蛋白的水解能力明显低于养殖环境中芽孢杆菌,这表明益生菌制剂中的芽孢杆菌未能在养殖系统成功定植。总之,文昌对虾养殖系统水体和底泥中的产蛋白酶细菌多样性丰富、结构复杂,且芽孢杆菌和弧菌为优势的土著菌种。菌群结构与水质指标的相关性分析结果表明,水体中总菌数量对水体中氨氮含量影响显著,随着水体总菌数的增加,氨氮先降低后升高。底泥中产蛋白酶菌数对亚硝态氮影响显著,随着底泥产蛋白酶菌的升高,亚硝态氮先降低后升高。水体中产蛋白酶细菌数量对硝态氮的含量影响显著,随着水体产蛋白酶菌的升高,硝态氮先降低后升高。因此,产蛋白酶菌群在对虾养殖生态系统氨氮、亚硝态氮、硝态氮等物质循环中发挥着重要作用。采用ERIC-PCR分型对水样优势菌进行分型,结果显示,80株欧文斯氏弧菌采用此种分型方法可以得到多态性较好的指纹图谱。这说明该技术也可作为欧文斯氏弧菌遗传多样性分析的可靠手段,这些菌株的ERIC-PCR指纹图谱为今后的流行病学调查和土著菌株鉴定提供了重要基础数据。对ERIC-PCR指纹图谱进行聚类分析,我们发现,当相似性系数为0.58时,所有菌株可分为4大类,其中Ⅳ类、Ⅲ类菌株数量最多,且在多个虾池均有分布。Ⅱ、Ⅰ类的菌株数量相对较少,且来源相对单一。这表明该片区不同虾池中的欧文斯氏弧菌有相似的遗传背景,可能存在爆发水媒性弧菌病的风险。16Sr DNA分析表明,本研究分离得到的欧文斯氏弧菌为土著菌,这为今后开发适用于海南地区对虾养殖的益生菌制剂提供了优良的菌种资源。