研究背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，具有严格的宿主和组织特异性，是全球感染性肝脏疾病的主要病因，据报道全球约每年100万的患者死于HBV感染导致的各种疾病，如肝功能衰竭、肝硬化和肝癌，严重威胁人类的健康。HBV本身不引起肝细胞病变，肝脏的病理变化主要取决于机体免疫应答，尤其细胞免疫应答。HBV导致的免疫损伤十分复杂，加之缺乏有效的动物疾病模型，故目前乙型肝炎发生发展的免疫病理机制尚不十分清楚。Th17型细胞是一种辅助性CD⁴⁺T细胞，能够分泌产生IL-17A（即IL-17）、IL-17F、IL-22、IL-6等细胞因子，孤独核受体γt （Orphan nuclear receptor gammat, RORγt）是调节Th17型细胞分化的关键转录因子。Th17型细胞可促进炎症的发生发展，与许多免疫性疾病的致病机制密切相关。现发现Th17型细胞及其相关的细胞因子在HBV相关的肝脏疾病中明显升高。但有关HBV抗原诱导的Th17型细胞在肝脏免疫病理损伤的作用，以及影响其分化的机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，本研究首先用HBV抗原定向诱导初始CD⁴⁺T细胞向Th17型细胞分化，并过继转移到能表达HBsAg和HBcAg的小鼠模型，以研究Th17型细胞在HBV感染中的致病作用；并进一步研究HBV抗原对Th17型细胞分化的影响及机制。第一部分HBV重组腺病毒的构建目的构建HBV重组腺病毒方法利用分子克隆技术将1.3倍HBV全基因组（ayw亚型）真核表达质粒与穿梭质粒pAdTrack连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-HBV。测序验证序列正确后，将重组穿梭质粒pAdTrack-HBV线性化转染到含有pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中构建HBV重组腺病毒质粒pAd-GFP/HBV1.3。测序验证后，将重组穿梭质粒pAd-GFP/HBV1.3线性化，用脂质体2000转染到HEK293AD细胞进行包装，并进一步扩增HBV重组腺病毒，用氯化铯梯度离心纯化HBV重组腺病毒，最后用HBV DNAFQ-PCR定量检测HBV重组腺病毒浓度。结果pAdTrack-HBV质粒和pAd-GFP/HBV质粒分别经酶切，在1%琼脂糖凝胶电泳，均可得到4.1Kb大小的酶切片段，大小与1.3倍HBV基因全长相符合。转染pAd-GFP/HBV质粒的HEK293AD细胞在24小时后开始表达GFP荧光蛋白，1周后出现细胞病理效应。扩增后的HBV重组腺病毒的HBV DNA含量为1.31×1010copies/ml，经氯化铯梯度离心纯化后病毒指数为7.89×1012copies/ml。结论成功构建HBV重组腺病毒（Ad-HBV）。第二部分HBV感染小鼠模型的建立及小鼠对HBV的免疫应答反应目的建立急性HBV感染小鼠模型，研究HBV感染早期小鼠的免疫反应及其肝组织学改变。方法尾静脉注射HBV重组腺病毒感染C57BL/6小鼠，在注射病毒后的第1、2、3、5、7天收集小鼠血液、脾脏和肝脏。分离小鼠血清，用改良赖氏法检测血清谷丙转氨酶；时间分辨免疫荧光分析方法（IFMA）定量检测血清HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe和抗HBc；HBV FQ-PCR定量检测血清HBV DNA。分离肝脏细胞，用HBsAg和HBcAg作用肝脏细胞后，ELISA检测细胞因子INF-γ、IL-4和IL-17；Real-time PCR检测肝脏组织HBV cccDNA；荧光显微镜观察肝脏组织GFP蛋白表达；HE染色切片检测小鼠肝脏组织病理学检查，免疫组化检测肝脏HBsAg和HBcAg表达。结果Ad-HBV组与Ad组C57BL/6小鼠在注射初期（1d、2d）均出现血清谷丙转氨酶轻度升高和肝脏组织轻度炎症反应，两组之间无统计学差异，第3天血清谷丙转氨酶和肝脏组织学改变基本恢复正常。小鼠感染Ad-HBV后的第1天血清检测到HBsAg和HBV DNA，肝脏组织也出现HBsAg、HBcAg的表达和HBV cccDNA，第3天最明显。感染后第5天检测到抗-HBs，第7天检测到抗-HBc，而抗-HBe一直为阴性；HBsAg和HBcAg作用后不影响肝脏细胞的INF-γ、IL-4和IL-17细胞因子分泌水平。结论尾静脉注射Ad-HBV能够构建急性HBV感染小鼠模型；Ad-HBV感染C57BL/6小鼠早期不产生特异性免疫反应与肝脏损伤作用。第三部分HBV抗原诱导的Th17型细胞对感染Ad-HBV小鼠的作用研究目的定向诱导HBV抗原特异性Th17型细胞，并研究其对感染Ad-HBV小鼠的作用。方法1．诱导HBV抗原特异性CD⁴⁺T细胞经C57BL/6小鼠鼻腔接种200μl含5×106copies HBV重组腺病毒的病毒悬液，4周后加强一次，再经1周后取小鼠脾脏单个核细胞，将细胞分三组：HBV抗原+细胞因子组，HBV抗原组和PBS组。HBV抗原+细胞因子组，用细胞因子（TGF-β1ng/mL、IL-610ng/mL、IL-2310ng/mL、抗IFN-γ5μg/mL、抗IL-45μg/mL）和HBV抗原（HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml）作用小鼠脾脏单个核细胞；HBV抗原组用HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml作用细胞；PBS组仅用PBS作用细胞。72小时后用CD⁴⁺T细胞磁珠分选脾脏单个核细胞的CD⁴⁺T细胞，把CD⁴⁺T细胞与抗原提呈细胞（通过Mitomycin C处理健康小鼠脾脏单个核细胞获得）按5：1混合，并加用上述刺激因素继续作用72小时。收集小部分细胞悬液用ConA刺激24小时后，ELISA检测上清中IL-17、IL-22、INF-γ和IL-4的水平；流式细胞术（FCM）分析IL-17+CD⁴⁺T细胞、INF-γ+CD⁴⁺T细胞和IL-⁴⁺CD⁴⁺T细胞的百分比；Real-time PCR检测细胞IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平。2．构建小鼠肝脏急性损伤模型通过C57BL/6小鼠尾静脉注射HBV重组腺病毒，感染病毒3天后予以细胞过继转移。洗涤上述培养的HBV抗原特异性CD⁴⁺T细胞，PBS重悬细胞，将200μl含2×107个细胞的悬液尾静脉注射给已感染HBV重组腺病毒3天的C57BL/6小鼠。24小时后处死小鼠，取小鼠血清用改良赖氏法检测谷丙转氨酶，取肝脏石蜡包埋，切片进行HE染色观察肝脏病理学改变。结果1．HBV抗原+细胞因子组IL-17+CD⁴⁺T细胞的百分比，以及IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平显著性高于HBV抗原组和PBS组，P＜0.01，且IL-17和IL-22分泌水平也显著性高于其它两组，P＜0.01。HBV抗原组的IL-17+CD⁴⁺T细胞百分比，以及IL-17和IL-22mRNA水平和分泌显著性高于PBS组，P＜0.01；HBV抗原组INF-γ+CD⁴⁺T细胞的百分比和INF-γ的分泌显著性高于HBV抗原+细胞因子组和PBS组，P＜0.01。HBV抗原+细胞因子组、HBV抗原组和PBS组IL-⁴⁺CD⁴⁺T细胞的百分比和IL-4分泌无显著性差异。2．HBV抗原+细胞因子组和HBV抗原组的CD⁴⁺T细胞分别过继转移给感染Ad-HBV的C57BL/6小鼠，均能导致小鼠血清谷丙转氨酶升高，以及肝脏组织明显的炎症反应，如肝细胞明显肿胀，部分坏死，肝脏结构紊乱，大量的炎症细胞浸润。结论1．用HBV抗原（HBsAg和HBcAg）联合细胞因子在体外成功定向诱导初始CD⁴⁺T细胞向Th17型细胞分化。2．HBV抗原特异性Th17型细胞可导致感染Ad-HBV小鼠的肝脏炎症反应与组织损伤。第四部分研究HBV抗原对Th17型细胞分化的影响及机制目的研究HBV抗原对小鼠Th17型细胞分化的影响及机制方法1．分别用重组HBsAg、HBcAg、HBeAg免疫C57BL/6小鼠，取三种抗原免疫组小鼠的脾脏单个核细胞，一部分细胞用相应HBV抗原（HBsAg20μg/ml，HBcAg2.5μg/ml，HBeAg2.5μg/ml）作用24小时，流式细胞术检测细胞的IL-17+CD4+T细胞百分含量。另一部分细胞用磁珠分选CD4+T细胞，并与相应抗原和小鼠腹腔巨噬细胞共同培养72小时，real-time PCR检测细胞的IL-17、IL-22和RORγtmRNA水平，以及培养液IL-17和IL-22的含量。2．检测HBV三种抗原免疫组脾脏单个核细胞的TLR2、3、4、7和9mRNA水平。分别用HBV抗原作用相应免疫组小鼠脾脏单个核细胞24小时，检测细胞IL-6和IL-23mRNA水平和分泌。不同剂量HBV抗原作用小鼠腹腔巨噬细胞24小时，检测IL-6、IL-23mRNA水平和分泌及其TLR7mRNA水平和蛋白表达。siRNA沉默巨噬细胞TLR7的表达，Western-Blot分析siRNA抑制效率；以siRNA-TLR7小鼠巨噬细胞为APC，分别加入三种不同的HBV抗原及相应的HBV抗原免疫的CD4+T细胞共同培养72小时，检测CD4+T细胞的IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平，以及IL-17和IL-22的分泌水平；用HBV抗原对siRNA-TLR7小鼠巨噬细胞作用后，检测其IL-6和IL-23的分泌和mRNA水平。结果1．HBsAg免疫组、HBcAg免疫组、HBeAg免疫组脾脏单个核细胞的IL-17+CD4+T细胞百分比显著性高于佐剂组，P＜0.01，且CD4+T细胞的IL-17和IL-22mRNA水平和分泌，以及RORγt mRNA水平均显著性高于佐剂组，P＜0.01，但程度不一致。IL-17mRNA水平和分泌依次是HBcAg组—HBeAg组—HBsAg组，三组间差异具有统计学意义，P＜0.01；IL-22mRNA水平和分泌依次是HBsAg免疫组—HBcAg免疫组—HBeAg免疫组，HBsAg免疫组显著性高于HBcAg和HBeAg免疫组，P＜0.01，而在HBcAg和HBeAg免疫组之间无显著性差异；RORγt mRNA水平依次是HBcAg免疫组—HBeAg免疫组—HBsAg免疫组，HBcAg免疫组显著性高于HBsAg和HBeAg免疫组，P＜0.01，而在HBsAg和HBeAg免疫组之间无显著性差异。2．与佐剂对照组比较， HBeAg免疫组小鼠脾脏单个核细胞的TLR2mRNA水平显著性升高，P＜0.01，HBcAg免疫组无明显改变，而HBsAg免疫组则表达显著性下降，P＜0.01；三种抗原免疫组TLR3mRNA水平无明显改变；HBcAg免疫组TLR4mRNA水平显著性升高，P＜0.01，HBeAg免疫组无明显改变，而在HBsAg免疫组其表达显著性下降，P＜0.01；三种抗原免疫组TLR7mRNA水平均显著性升高（P＜0.01），以HBcAg免疫组升高最明显；三种抗原免疫组TLR9mRNA水平均显著下降（P＜0.01）。HBsAg、HBcAg和HBeAg免疫组脾脏单个核细胞的IL-6mRNA水平和分泌均高于佐剂组；而HBcAg和HBeAg免疫组IL-23mRNA水平和分泌显著性高于佐剂组，P＜0.05。体外小鼠巨噬细胞在HBsAg、HBcAg和HBeAg作用下TLR7mRNA水平和蛋白表达显著性升高，P＜0.01。在HBcAg和HBeAg作用下，巨噬细胞IL-6和IL-23mRNA水平和分泌显著性升高，P＜0.01，呈浓度依赖关系，且以HBcAg作用最明显；HBsAg作用巨噬细胞仅IL-6mRNA水平和分泌显著性升高，P＜0.01。siRNA-TLR7抑制靶基因效率近70%；siRNA-TLR7能显著性抑制能显著性抑制三种HBV抗原（HBsAg、HBcAg和HBeAg）免疫组小鼠CD4+T细胞IL-17、IL-22mRNA水平和分泌及RORγt mRNA水平的上调（P＜0.01）；能显著性抑制三种HBV抗原上调小鼠巨噬细胞的IL-6mRNA分泌和水平（P＜0.01），及显著性抑制HBcAg和HBeAg上调小鼠巨噬细胞IL-23mRNA水平和分泌（P＜0.05）。结论1．HBsAg、HBcAg和HBeAg能够促进Th17型细胞分化，以HBcAg诱导作用最强；HBcAg和HBeAg诱导的Th17型细胞以分泌IL-17为主；HBsAg诱导的Th17型细胞以分泌IL-22为主。2．HBcAg和HBeAg通过上调小鼠巨噬细胞TLR7表达，增加IL-6和IL-23分泌，诱导Th17型细胞分化，而HBsAg通过上调小鼠巨噬细胞TLR7表达，仅增加IL-6分泌，诱导Th17型细胞分化。