【摘 要】
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目的:使用巴斯德毕赤酵母表达系统对白喉毒素截短体DT390和鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白进行融合表达,并通过在体试验评价融合蛋白VP2-DT390的免疫原性。方法:1.以本实验室前期构建的pw PICZalpha-VP2为模板,采用PCR扩增出本试验所需的VP2基因,与pw PICZalpha-DT390连接,构建重组表达载体pw PICZalpha-DT390-VP2。利用电转化的方法将pw P
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201903D421037）；
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目的:使用巴斯德毕赤酵母表达系统对白喉毒素截短体DT390和鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白进行融合表达,并通过在体试验评价融合蛋白VP2-DT390的免疫原性。方法:1.以本实验室前期构建的pw PICZalpha-VP2为模板,采用PCR扩增出本试验所需的VP2基因,与pw PICZalpha-DT390连接,构建重组表达载体pw PICZalpha-DT390-VP2。利用电转化的方法将pw PICZalpha-DT390-VP2导入到毕赤酵母JW107中,Zeocin抗性筛选阳性克隆菌株,经甲醇诱导表达后收获表达上清液,使用镍柱纯化带有6×His标签的融合蛋白VP2-DT390,采用SDS-PAGE和Western blot对融合蛋白进行鉴定。2.融合蛋白VP2-DT390以0.83μmol/只的剂量肌肉注射对21日龄雏鸡进行首次免疫,在首次免疫后两周用同样的方式进行加强免疫;ELISA检测首次免疫当天及首次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d雏鸡血清中抗IBDV-VP2特异性抗体滴度。3.在首次免疫28d后使用BC6/85毒株靶动物攻毒保护试验用感染49日龄SPF鸡,通过法氏囊眼观和镜检病变、法氏囊组织病理损伤评分等对融合蛋白VP2-DT390的免疫保护效果进行评价。结果:1.SDS-PAGE和Western blot结果显示,成功表达和纯化了融合蛋白VP2-DT390,且1 L的培养液可获得10 mg融合蛋白。2.对首次免疫当天及首次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d雏鸡血清中的IBDV-VP2抗体滴度进行单因素方差分析,结果显示:VP2组与PBS组的特异性抗体滴度从首次免疫前至首次免疫后28 d均无显著性差异（P＞0.05）;在首次免疫后第21天VP2-DT390免疫雏鸡的特异性抗体滴度显著高于B87疫苗组、VP2组和PBS组（P＜0.05）;首次免疫后28天VP2-DT390免疫雏鸡的特异性抗体滴度显著高于VP2组和PBS组（P＜0.05）,与B87疫苗组无显著性差异（P＞0.05）,表明DT390显著增强了VP2的免疫原性。3.法氏囊病理解剖结果显示:B87免疫后雏鸡的法氏囊组织中淋巴滤泡密切排列,皮质和髓质之间界限清晰,无明显病理变化;与B87组相比,VP2-DT390免疫后雏鸡的法氏囊有严重的淋巴滤泡萎缩,结缔组织增生等病变;VP2组免疫后雏鸡的法氏囊存在严重的淋巴滤泡萎缩、淋巴细胞耗竭、结缔组织增生等病变。PBS免疫后雏鸡的法氏囊发生了严重的淋巴滤泡萎缩、淋巴细胞耗竭、结缔组织增生等病变。经过对各组法氏囊组织切片进行病理损伤评分发现,VP2-DT390组与PBS组无差异,且显著高于B87组。结合各组的临床症状、镜检和眼观病变,说明融合蛋白VP2-DT390未能保护SPF雏鸡免受BC6/85病毒的感染。结论:利用毕赤酵母表达系统成功表达并鉴定了融合蛋白VP2-DT390,DT390能够增强VP2在鸡机体内的免疫原性。
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